郭麗璇，李 軍，張 茹，龍子臨，鄧 越，朱玉瑩，鐘炘燮，丁 霞

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

卵巢儲備功能是指卵巢內(nèi)存留卵泡的數(shù)量和質(zhì)量，反映了女性生育能力。當(dāng)卵巢內(nèi)存留的可募集卵泡數(shù)目減少，卵巢產(chǎn)生卵子能力減弱，形成卵母細(xì)胞能力下降，包括卵泡數(shù)量和(或)質(zhì)量的下降，稱為卵巢儲備功能下降(Decreasing Ovarian Reserve，DOR)。DOR在＞45歲女性中為正常生理現(xiàn)象，在40歲前則被稱為病理性DOR。病理性DOR患者可無臨床癥狀，或主要表現(xiàn)為周期紊亂、經(jīng)期縮短、經(jīng)量減少及經(jīng)色黯淡，甚則閉經(jīng)、不孕[1]。如不積極干預(yù)將導(dǎo)致卵子耗竭，由量變到質(zhì)變，大約1～6年的時間內(nèi)可發(fā)展為卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）[2]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。DOR目前尚未有流行病學(xué)調(diào)查報道，但從臨床上對患者的觀察中，DOR發(fā)病率日益增高，并具年輕化趨勢。流行病學(xué)研究顯示，DOR在女性人群中發(fā)病率為10%[3]；卵巢早衰在一般人群中發(fā)病率為0.9%～3%，在閉經(jīng)者中占2%～10%[4]；治療上，西醫(yī)采用建立人工周期療法，但僅能改善患者癥狀、延緩閉經(jīng)，無明顯提高生育能力的療效。中醫(yī)多認(rèn)為此病以腎虛為本，病機復(fù)雜，虛實夾雜。郭志強教授認(rèn)為腎虛肝郁是DOR發(fā)生的主要病機，并以滋腎養(yǎng)肝法治療DOR，在緩解癥狀及提高生育能力等方面，臨床療效顯著[5-6]。本實驗選取郭志強教授滋腎養(yǎng)肝法的君臣藥物“枸杞子”“月季花”制成代茶飲“杞月茶”，利用動物實驗探討“杞月茶”對DOR的療效，旨在研究針對DOR更便捷、普及的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雌性SD大鼠50只（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物中心提供），8周齡，體質(zhì)量約200～220 g。

1.2 實驗藥品 1）環(huán)磷酰胺，由江蘇盛迪有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32020857。2）中藥，枸杞子茶：枸杞子15 g，自煎，濃縮；月季花茶：月季花15 g，自煎，濃縮；杞月茶：枸杞15 g，月季花10 g，自煎，濃縮。3）芬嗎通，由Abbott Biologicals B.V.公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：H20150345。

1.3 實驗條件 室內(nèi)保持22～25 ℃，自由飲水進食，晝夜間斷照明，水料充足，規(guī)律更換。

1.4 實驗器材 1）倒置相差顯微鏡：由北京東直門醫(yī)院動物實驗室提供；2）JA2003千分之一電子天平：由北京東直門醫(yī)院動物實驗室提供；3）酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒：南京森貝伽生物科技有限公司；4）臺式低速離心機：由北京東直門醫(yī)院動物實驗室提供。

1.5 實驗方法

1.5.1 觀察陰道脫落細(xì)胞 適應(yīng)性喂養(yǎng)（1周）期間，對雌鼠連續(xù)5～10 d做陰道脫落細(xì)胞涂片觀察。用小頭棉簽蘸取0.9%氯化鈉注射液后插入大鼠陰道內(nèi)0.5～1 cm，旋轉(zhuǎn)1周取出分泌物后均勻涂在載玻片上，并伊紅染色后直接置于顯微鏡下進行細(xì)胞學(xué)檢查，選擇動情周期為4～5 d的正常大鼠進行實驗。大鼠動情周期可分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期四期，各階段的細(xì)胞學(xué)特征，見表1。

表1 大鼠動情周期陰道脫落細(xì)胞學(xué)特征

1.5.2 分組及造模 在入選的50只大鼠中隨機選取5只作為空白對照組，余45只造模。造模方法選用環(huán)磷酰胺腹腔注射 30 mg/(kg·d)，連續(xù)注射5 d[7]，以建立卵巢儲備功能下降的大鼠模型。從腹腔注射結(jié)束后，每日觀測陰道脫落細(xì)胞，共觀察3個動情周期，動情周期紊亂（角化細(xì)胞持續(xù)出現(xiàn)7～8 d）提示造模成功。將造模成功的45只大鼠隨機分為模型組5只，枸杞子組、月季花組、杞月茶組及芬嗎通組各10只。

1.5.3 治療方法 造模成功后，給各組大鼠每日灌胃1次，連續(xù)灌胃4周，每周停止灌胃1 d。用藥用量，1）空白對照組：每日以l mL/100 g蒸餾水灌胃。2）模型組：每日以l mL/100 g蒸餾水灌胃。3）枸杞組：枸杞子顆粒劑，溫水沖泡后以3.15 g/（kg·d）灌胃。4）月季花組：月季花顆粒劑，溫水沖泡后以2.1 g/（kg·d）灌胃。5）杞月茶組：顆粒劑，每包含枸杞子15 g，月季花10 g，溫水沖泡后以5.25 g/（kg·d）灌胃。6）芬嗎通組：動情期用白色片溫水沖泡后以1.26 mg/（kg·d）灌胃，動情后期和動情間期用橙色片溫水沖泡后以0.21 mg/（kg·d）灌胃。

1.5.4 動物采血 治療結(jié)束再觀察5 d后，將大鼠再次稱質(zhì)量，采用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，選用腹主動脈采血方法取血，置于離心機中，離心力568×g，離心15 min。離心后取上清清液，置于-20 ℃冰箱中保持備用。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況觀察 每日給藥前觀察大鼠精神狀態(tài)、活動情況、皮毛顏色、攝食飲水、大便性狀等。隔日稱1次體質(zhì)量，觀察體質(zhì)量變化，直到處死大鼠。

1.6.2 陰道上皮脫落細(xì)胞學(xué)涂片 每天早上8:00給每只大鼠進行陰道涂片，于光學(xué)顯微鏡下觀察性周期的變化，判斷動情周期，直到處死大鼠。

1.6.3 卵巢功能相關(guān)生化指標(biāo)的檢測 用放射免疫分析法檢測大鼠血清雌二醇（E2）水平，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）水平、黃體生成素（LH）水平、FSH/LH比值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用 SPSS 17.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，研究數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，根據(jù)不同的要求采用不同的檢驗方法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況變化比較 除空白對照組外，其余各組大鼠在造模后均出現(xiàn)不同程度消瘦及精神萎靡癥狀，毛發(fā)凌亂、粗糙缺少光澤，攝食飲水較前減少。經(jīng)過治療后的各組大鼠情況有所改善，攝食飲水較前增加，體質(zhì)量較前稍有上升，精神較前好轉(zhuǎn)，毛發(fā)趨于柔順光澤等，而模型組大鼠則精神相對萎靡不振，體型消瘦，進食較少，毛發(fā)無光。各組大鼠造模前與治療后體質(zhì)量變化情況比較，見表2。

表2 各組大鼠造模前與治療后體質(zhì)量變化情況比較 g

2.2 各組大鼠動情周期變化比較 造模前各組大鼠及空白對照組大鼠動情周期為4～5 d；模型組3只大鼠動情周期延長至處死當(dāng)天，2只大鼠為6～8 d；治療組大鼠動情周期杞月茶組4～6 d，芬嗎通組4～5 d，枸杞子組及月季花組均為5～8 d。

2.3 各組大鼠基礎(chǔ)性激素水平變化比較 見表3。

表3 大鼠基礎(chǔ)性激素水平變化比較

3 討論

隨著社會環(huán)境和生活習(xí)慣的變化，DOR發(fā)病率日益升高且趨于年輕化，若未得到積極治療，可進一步發(fā)展為POF，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。臨床治療中，西醫(yī)多采用雌孕激素人工周期療法或輔助生殖技術(shù)。激素類療法，雖然可以使患者出現(xiàn)規(guī)律的月經(jīng)，改善相關(guān)癥狀，但不能明顯提高女性妊娠率，且不良反應(yīng)較多。此外，在人工周期治療期間，西藥往往會抑制排卵而不能受孕，無法滿足育齡期女性需求。而輔助生殖技術(shù)又費用過高，并且成功率受到卵子質(zhì)量好壞限制的局限性。

中醫(yī)則強調(diào)“整體觀念”，注重對人體多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)，對本病的治療有一定優(yōu)勢，被越來越多的患者所接受。中醫(yī)還強調(diào)“治未病”的思想，DOR可認(rèn)為是POF的“未病”階段，在“治未病”思想指導(dǎo)下，若積極及時有效地治療DOR，可逆轉(zhuǎn)或截斷病程，防止其向POF轉(zhuǎn)變。另一方面，中醫(yī)中藥可從根本上調(diào)理肝腎功能，可以提高機體內(nèi)分泌腺體功能，增加體內(nèi)性激素，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境，在緩解癥狀的同時，保護、恢復(fù)卵巢功能，在一定程度上提高患者生育能力。

郭志強教授從事男女不孕癥疾病的研究50余年，尤其關(guān)注DOR的中醫(yī)治療。郭志強教授遵循《傅青主女科·調(diào)經(jīng)》 “經(jīng)本于腎”“經(jīng)水出諸腎”“經(jīng)水非血，乃天一之水，出自腎中”“經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸”等論述，亦認(rèn)為腎虛是女性經(jīng)水早絕的主要病機，但同時注重“腎非肝氣之相通，則腎氣不能開”“女子以肝為先天”，足厥陰肝經(jīng)與沖任二脈互為溝通；肝藏血，主疏泄，性喜條達(dá)，肝司血海，沖為血海。若肝氣平和，則經(jīng)脈流暢，血海寧靜，月事正常；若婦女?dāng)?shù)傷于血，氣分偏盛，七情內(nèi)傷，則肝失條達(dá)，氣機郁滯，從而導(dǎo)致沖任充盈不足或失于通利，出現(xiàn)月經(jīng)不調(diào)?！陡登嘀髋啤芬鄰娬{(diào)從肝論治月經(jīng)病，注重肝“體陰而用陽”的生理特點和臟腑間五行制化關(guān)系，多采用疏肝解郁、平肝降逆、清肝瀉火、養(yǎng)血柔肝、滋水涵木等調(diào)肝方法[8]。郭志強教授認(rèn)為腎虛肝郁是DOR發(fā)生的主要病機，提出中藥以滋腎養(yǎng)肝法治療DOR，臨床上療效顯著[5-6]。但在臨床上，仍存在著部分患者因癥狀較輕，不能引起足夠重視或生活節(jié)奏快、外出工作等原因未能按時服用，加之晚婚晚育帶來的女性對于延長卵巢功能最佳狀態(tài)的高需求，臨床中需要探求更普遍化、便捷化的中醫(yī)治療方法。

本研究選用郭志強教授臨床常用滋腎養(yǎng)肝法的君臣藥——“枸杞子”“月季花”以代茶飲“杞月茶”形式進行研究。枸杞子性平味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、潤肺止咳之功。善于治療腎虛腰痛、遺精滑精、月經(jīng)不調(diào)、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、目暗不明、頭暈?zāi)垦?、陰虛勞嗽等證[9]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞子可降糖降脂、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、增強免疫力[10]，具有一定抗抑郁作用[11]、舒緩情志。研究[12]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖還可改善小鼠造血功能及肝腎功能。月季花性溫，味甘，歸肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)，解毒消腫之功，主入肝經(jīng)血分，主要用治肝郁不舒、瘀血阻滯所致月經(jīng)不調(diào)。現(xiàn)代研究[13]發(fā)現(xiàn)月季花的主要活性成分為黃酮類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、沒食子酸等，其中黃酮類成分具有增強機體免疫及抗癌等活性。臨床可用于治療隱性冠狀動脈性心臟病、月經(jīng)不調(diào)、頸淋巴結(jié)炎、無名腫痛、月經(jīng)痛、肺虛咳嗽咯血、產(chǎn)后陰挺等。且根據(jù)文獻統(tǒng)計，現(xiàn)治療卵巢儲備功能下降的臨床常用中藥亦以歸肝、腎經(jīng)的藥味為主[14]。2藥相伍制成代茶飲“杞月茶”，既補腎填精養(yǎng)血，又柔肝疏肝、理氣活血，治療精血不足兼夾氣滯血瘀之月經(jīng)量少、月經(jīng)后錯、閉經(jīng)等卵巢儲備功能低下之月經(jīng)不調(diào)，充分運用中醫(yī)中藥從根本上調(diào)理肝腎，刺激卵巢發(fā)育和卵泡生長，在緩解癥狀的同時提高一定的生育能力。

本實驗發(fā)現(xiàn)，枸杞子及月季花單味藥物對于DOR無明顯治療作用，但 “杞月茶”對于DOR具有明顯治療作用，且與芬嗎通治療療效相似。此外，“杞月茶”相較于激素類藥物不良反應(yīng)少，可以代茶飲形式服用，具有更加便捷的優(yōu)點，從而更好的治療DOR，防微杜漸，預(yù)防POF的發(fā)生，為進一步研發(fā)改善卵巢功能的保健品奠定一定基礎(chǔ)。