張建東，陳永林，馬宏偉，劉天駒，張 濤，李 釗，趙建東，米吉提·莫合他爾汗，顏成旭，路廣計，張喜悅

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271000；2.洛陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南洛陽 471000；3.河北省動物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊 050000；4.石家莊市動物疫病預(yù)防控住中心，河北石家莊 050000；5.濟源市動物疫病控制中心，河南濟源 459000；6.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830000；7.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

牛結(jié)核病（bovine tuberculosis，bTB）是由分枝桿菌屬牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis，M.bovis）引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染性疾病，給我國養(yǎng)牛業(yè)帶來嚴(yán)重危害[1]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。牛分枝桿菌感染宿主廣泛，除可感染人外，還可感染50 多種哺乳動物[2]。牛結(jié)核病目前尚無有效疫苗預(yù)防，藥物治療成本太高，所以“檢測+撲殺”是控制該疫病的主要手段。

我國目前的牛結(jié)核病檢測方法主要包括，結(jié)核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（TST）、比較皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗（SICTT）、γ-干擾素ELISA試驗（IFN-γ-ELISA）、抗體ELISA 試驗和膠體金檢測等[3]。TST 是我國牛結(jié)核病檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，也是國際貿(mào)易指定方法。此方法靈敏度高，但特異性差，無法排除其他結(jié)核桿菌干擾。SICTT 與TST相比，可排除其他桿菌干擾，減少假陽性。TST 和SICTT 檢測成本低，但操作麻煩、耗時長，結(jié)果判定主觀性強[4]。IFN-γ-ELISA 試驗操作簡單，但成本較高[5]?？贵wELISA是現(xiàn)代抗體檢測的主要方法，但牛分枝桿菌抗原表位復(fù)雜，不同階段可產(chǎn)生不同抗體，因而導(dǎo)致檢測陽性率偏低[6]。

結(jié)核病污染場內(nèi)，牛分枝桿菌普遍存在，需要敏感性更高的檢測方法，來盡量避免漏檢，從而加快凈化進(jìn)程。本試驗采用TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測方法，同時對牛結(jié)核病污染場的牛群進(jìn)行檢測，比較分析不同試驗的檢測結(jié)果，以期為我國牛結(jié)核病污染場的凈化提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 牛PPD、禽PPD、INF-γ 夾心ELISA 檢測試劑盒（批次P201906-001），均購自青島瑞爾公司；牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測試劑盒（批號190504），購自韓國安世佳合有限責(zé)任公司。儀器包括：剪毛剪、0.5 mL 注射器、游標(biāo)卡尺、酶標(biāo)儀（包含450 nm 和620～650 nm 濾光片）、CO2培養(yǎng)箱、12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、肝素鈉采血管、移液器及吸頭等。

1.1.2 試驗動物 某規(guī)模養(yǎng)殖場的300頭泌乳牛。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

1.2.1.1 TST 試驗 按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動物結(jié)核病診斷技術(shù)》（GB/T 18645—2002）的要求操作和結(jié)果判定：采用牛型PPD，劑量為2 000 IU，分別于注射前和注射后72 h 測量皮膚厚度，并計算皮厚差。皮厚差≥4.0 mm，為陽性；2.0 mm ≤皮厚差＜4.0 mm，為疑似；皮厚差＜2.0 mm，為陰性。疑似牛于第1 次檢疫 60 d 后進(jìn)行復(fù)檢，仍為疑似時，60 d 后再復(fù)檢，如仍為疑似，則判為陽性。

1.2.1.2 SICTT 試驗 采用牛PPD 和禽PPD，在牛頸部左側(cè)分點皮內(nèi)注射，注射點間隔12～15 cm，72 h 后，觀察注射部位的炎性反應(yīng)，并量取皮皺厚，根據(jù)皮皺厚增加值判定。牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差＞4 mm，判為陽性；1 mm ＜牛型PPD 皮厚差減去禽型PPD 皮厚差≤4 mm，判為可疑；牛型PPD 皮厚差≤禽型PPD 皮厚差，判為陰性。

1.2.1.3 IFN-γ-ELISA 試驗 采集5 mL 血液肝素抗凝血液，各取1.5 mL 加入3 個孔中，然后分別取100 μL 的牛型PPD、禽型PPD 和陰性對照磷酸鹽緩沖液（PBS），加入抗凝全血中，混勻后放于含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h。用移液器小心吸取培養(yǎng)上清，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，即獲得刺激產(chǎn)生的γ-干擾素上清。取出單抗包被板，每孔加入50 μL 樣品稀釋液，然后加入50 μL 待測樣品或?qū)φ?，混勻后室溫作? h；洗滌，每孔加入100 μL 酶標(biāo)抗體，室溫作用1 h；洗滌后每孔加入100 μL 底物，室溫避光作用30 min 后，加入終止液，測定OD450nm值。當(dāng)牛型PPD 刺激上清的OD 值-PBS 刺激上清的OD 值≥0.1，且牛型PPD 刺激上清OD 值-禽型PPD 刺激上清OD值≥0.1，為陽性，反之為陰性。

1.2.1.4 抗體ELISA 試驗 按照牛分枝桿菌ELISA 抗體檢測試劑盒操作步驟進(jìn)行，計算S/P值。S/P=（樣品OD450nm平均值-陰性對照OD450nm平均值）/（陽性對照OD450nm平均值-陰性對照OD450nm平均值）。S/P≥0.3 為陽性，S/P＜0.3為陰性。

1.2.2 評估方法 以TST 試驗為參考標(biāo)準(zhǔn)，分別與SICTT、IFN-γ-ELISA、抗體ELISA 檢測結(jié)果比較，計算符合率，并運用SPSS 軟件進(jìn)行對比，分析敏感性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TST 與IFN-γ-ELISA

對比結(jié)果（表1）顯示：TST 檢出陽性114 份，IFN-γ-ELISA 檢出陽性154 份，符合率為72.7%，經(jīng)SPSS 分析，P＜0.05，說明IFN-γ-ELISA 陽性檢出率顯著高于TST，表明其敏感性明顯高于TST。

表1 TST 與IFN-γ-ELISA 檢測結(jié)果對比 單位：份

2.2 TST 與SICTT

對比結(jié)果（表2）顯示：TST 檢出陽性114份，SICTT 檢出陽性103 份，符合率為96.3%，經(jīng)SPSS 分析，P＞0.05，說明SICTT 陽性檢出率略低于TST，但差異不顯著，表明兩種方法的敏感性相似。

表2 TST 與SICTT 檢測結(jié)果對比 單位：份

2.3 TST 與抗體ELISA

對比結(jié)果（表3）顯示：TST 檢出陽性114 份，抗體ELISA 檢出陽性21 份，符合率為69.0%，經(jīng)SPSS 分析，P＜0.05，說明抗體ELISA 陽性檢出率顯著低于TST，表明其敏感性明顯低于TST。

表3 TST 與抗體ELISA 檢測結(jié)果對比 單位：份

3 討論

近年來，我國牛結(jié)核病流行率普遍升高，結(jié)核病污染場數(shù)量逐漸增加[7]。本試驗利用4 種檢測方法，對結(jié)核病污染場的奶牛進(jìn)行檢測。以TST為參考標(biāo)準(zhǔn)，分別與其他3 種方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ-ELISA 敏感性最高，明顯大于TST，而其他2 種方法的敏感性都低于TST。在牛結(jié)核病污染場的凈化過程中，要將所有感染牛盡可能全部篩檢出來，這就需要敏感性高的檢測方法，因此IFN-γ-ELISA 是首選的檢測方法。

TST 試驗是國家標(biāo)準(zhǔn)，也是國際貿(mào)易指定方法，但其結(jié)果判定存在人為誤差，尤其是大量檢測時，會出現(xiàn)陽性漏檢。在牛結(jié)核病污染場的凈化初期，需要進(jìn)行大量檢測，如果采用TST 檢測，就會漏檢感染牛，使其繼續(xù)污染牛群[8-9]。SICTT 雖然可排除禽結(jié)核桿菌的干擾，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但其陽性檢出率更低，同樣不適合牛結(jié)核病污染場初期的凈化?？贵wELISA 檢測是現(xiàn)代血清檢測的主要方法，操作簡單、耗時少，但因不同感染階段的牛分支桿菌抗體比較復(fù)雜，無法準(zhǔn)確捕獲[10]，導(dǎo)致陽性檢出率也明顯比TST 偏低，因此也不適合用于牛結(jié)核病污染場初期的凈化檢測。

TST 和SICTT 這兩種方法適合在基層推廣，成本低，但主觀性強，檢測過程對牛的應(yīng)激影響較大[11]?？贵wELISA 檢測時間短，出結(jié)果快，但成本較高，陽性檢出率偏低[12]。IFN-γ-ELISA 操作復(fù)雜、成本高，檢測要求較高，不適合在基層推廣，但檢測敏感性高[13]。因此，在實際的牛結(jié)核病檢測中，應(yīng)根據(jù)不同的需要和條件，選擇合適的檢測方法，也可以不同方法聯(lián)合使用。在條件不允許情況下，可以用TST 對牛結(jié)核病污染場進(jìn)行檢測。因IFN-γ-ELISA 是4 個方法中最敏感的方法[14]，所以在條件允許的情況下，在牛結(jié)核病污染場最適合選用，這樣可以盡量避免漏檢感染牛。在牛結(jié)核病污染場，患結(jié)核病的牛數(shù)量較多，如果檢測方法不敏感，就會導(dǎo)致大量陽性牛漏檢，使牛群凈化困難[15]。如果每年春秋兩季，對牛場進(jìn)行IFN-γ-ELISA 檢測，及時隔離淘汰陽性牛，連續(xù)檢測幾年，牛場就會達(dá)到凈化目標(biāo)[16]。

4 結(jié)論

評估認(rèn)為，在TST、SICTT、IFN-γ-ELISA 和抗體ELISA 4 種檢測方法中，IFN-γ-ELISA 方法敏感性最高，陽性檢出率最高，可以盡可能地將感染牛全部檢出，減少漏檢，因此最適合用于牛結(jié)核病污染場初期的凈化。