付小瓊，李超，劉逢舉，劉媛，彭軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000）

植物DNA 的提取是開展分子生物學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，一般應(yīng)用低溫保鮮方法如液氮或冰袋保存植物葉片，防止DNA 的降解和氧化，但攜帶均不方便。近年來硅膠干燥法是研究人員貯藏植物組織時(shí)最常用的方法，效果較好[1-3]，但是一般需要干燥48 h，中間還需要更換干燥劑，操作比較麻煩。 目前急需1 種可以快速烘干植物葉片提取DNA 的方法。 本研究采用微波爐干燥葉片的方法處理新鮮棉葉，用干燥后的棉葉提取DNA 并開展了后續(xù)的試驗(yàn)，效果較好。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種GK102 和石抗126 于2015 年種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場（河南省安陽縣白璧鎮(zhèn)）試驗(yàn)地。

1.2 微波爐型號

微波爐為格蘭仕集團(tuán)產(chǎn)品，型號為G80F23N1PM8，微波爐的工作頻率為2 450 MHz。

1.3 處理方法

分別用棉花平展子葉、未平展的真葉（未展真葉）、平展的嫩葉以及平展的成熟葉作為試驗(yàn)材料，用微波爐不同的火力烘干，低火烘10 min，中火烘6 min，高火烘4 min。

1.4 DNA 的提取方法及簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat,SSR）引物檢測

參考付小瓊[4]方法進(jìn)行DNA 的提取，稍加改進(jìn)， 取干葉50 mg， 水浴時(shí)間延長至60 min 左右，DNA 烘干后溶解于100μLddH2O。所得DNA 用4 對SSR 核心引物（表1）擴(kuò)增，檢測DNA 擴(kuò)增的效果。

表1 SSR 引物序列

1.5 DNA 質(zhì)量檢測

利用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000 檢測DNA 的質(zhì)量濃度和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用微波爐中火烘干真葉的試驗(yàn)結(jié)果

采集GK102 未展真葉、 平展嫩葉和平展成熟葉，在微波爐中用中火烘干后提取DNA。利用SSR引物NAU2026、CS62、NAU1042 和NAU1369 擴(kuò)增帶型見圖1。 結(jié)果顯示，未展真葉經(jīng)微波爐中火干燥后提取的DNA 均不能擴(kuò)增出目的條帶；平展嫩葉和平展成熟葉經(jīng)微波爐的中火干燥后提取的DNA 均能擴(kuò)增出清晰的目的條帶。 表明， 未展真葉不宜用微波爐烘干后提取DNA，而平展嫩葉和平展成熟葉經(jīng)微波爐干燥后， 可以成功提取DNA。 為此， 平展嫩葉和平展成熟葉統(tǒng)稱全展真葉，以區(qū)別于未展真葉，以下試驗(yàn)中真葉取樣均為全展真葉。

圖1 GK102 不同葉齡葉片烘干后DNA 的擴(kuò)增情況

2.2 不同火力烘干處理棉花全展真葉的比較

采集GK102 全展真葉隨機(jī)分為3 組， 分別用低火、 中火和高火烘干， 干燥后當(dāng)天提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測和SSR 擴(kuò)增。 結(jié)果顯示，引物一致性高，重復(fù)性好，且與棉花品種指紋圖譜庫的主帶結(jié)果一致（圖2）。 表明，棉花全展真葉可以在微波爐中經(jīng)低火、中火和高火干燥；雖然OD260/OD280值偏高（表2），但不影響后續(xù)的SSR 分子鑒定試驗(yàn)。

表2 不同火力烘干處理下全展真葉提取的DNA 質(zhì)量

圖2 GK102 全展真葉不同火力烘干處理下的DNA 擴(kuò)增帶型

2.3 不同火力烘干平展子葉的比較

采集石抗126 的平展子葉， 隨機(jī)分為3 組，分別用低火、 中火和高火烘干。 干燥后當(dāng)天提取的DNA 檢測結(jié)果見表3，擴(kuò)增帶型見圖3。試驗(yàn)表明，棉花平展子葉在微波爐中經(jīng)低火、中火和高火干燥后提取DNA，雖然OD260/OD280值偏高（表3），但不影響后續(xù)的SSR 分子鑒定試驗(yàn)。

表3 不同火力烘干的平展子葉提取DNA 的質(zhì)量檢測結(jié)果

2.4 烘干葉片保存1 周后的試驗(yàn)結(jié)果

干燥平展子葉和全展真葉分別裝入2 mL 的離心管中密封，室溫下放置1 周后，分別提取DNA 并進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4。SSR 引物擴(kuò)增后的圖譜見圖4 和圖5。 表明，棉花平展子葉和全展真葉經(jīng)微波爐干燥后放置1 個(gè)星期提取的DNA 的質(zhì)量仍較好。

圖3 引物CS62 擴(kuò)增石抗126 平展子葉DNA 的帶型

表4 烘干葉片后室溫保存1 周后提取的DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

圖4 石抗126 平展子葉烘干后1 周提取的DNA 經(jīng)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

圖5 GK102 全展真葉烘干后1 周提取的DNA 經(jīng)SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

2.5 鮮葉提取的DNA 質(zhì)量與烘干全展真葉提取的對比

采集GK102 鮮葉200 mg 左右，用常規(guī)CTAB法[4]提取DNA 的質(zhì)量濃度為1 621.5 mg·L－1，比烘干葉片（表2）高，OD260/OD280比值為1.91，處于正常范圍，比烘干葉片低。

用1%瓊脂糖凝膠電泳比較低火、 中火和高火分別干燥的全展真葉提取的DNA 和鮮葉片提取的DNA 結(jié)果（圖6）顯示，新鮮葉片提取的DNA 主帶明亮，干燥葉片提取的DNA 主帶較淺，表明新鮮葉片提取的DNA 量較大。 比較烘干葉片和新鮮葉片所得的圖譜看出，烘干葉片提取DNA 的擴(kuò)增圖譜背景較黑，新鮮葉片提取的DNA 擴(kuò)增圖譜背景淺（圖7），說明烘干葉片提取的DNA 中含有較多的雜質(zhì)，但不影響試驗(yàn)的結(jié)果，不影響譜帶的讀取。

圖6 干燥葉片和鮮葉片提取的DNA 樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖7 GK102 干燥葉和鮮葉提取的DNA 的SSR 引物NAU1369 擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

未平展的棉花幼嫩葉片含水量高， 組織過嫩，經(jīng)微波爐烘干后組織易被氧化破壞；試驗(yàn)中一般采集全展的真葉。 未平展的棉花嫩葉干燥后提取DNA 的SSR 引物擴(kuò)增效果差，這與程中平等[5]用桃嫩葉研究結(jié)果是一致的。用微波爐烘干磨碎的葉片， 加入細(xì)胞裂解液后須適當(dāng)延長65 ℃水浴時(shí)間至60 min， 所得DNA 需用離心機(jī)沉淀，DNA 得率較低。用微波爐不同的火力烘干平展子葉和全展真葉，均不影響DNA 的質(zhì)量以及后續(xù)的SSR 分子檢測工作；烘干時(shí)間短，僅需4～10 min。 烘干葉片的DNA OD260/OD280比值稍高于鮮葉， 但不影響SSR的分子檢測試驗(yàn)。棉花平展子葉與全展真葉經(jīng)微波爐干燥后提取的DNA 濃度和質(zhì)量不受干燥后放置時(shí)間的影響。棉葉經(jīng)微波爐烘干后可以密封室溫放置、便于運(yùn)輸，且DNA 可隨用隨提，方便異地取樣和攜帶。

一些基層育種單位不具備分子試驗(yàn)的條件，用鮮葉做試驗(yàn)送樣麻煩，應(yīng)用微波爐烘干后寄往開展分子試驗(yàn)的單位快捷方便。育種家在野外考察或在試驗(yàn)基地工作時(shí)發(fā)現(xiàn)有特異性狀的個(gè)體時(shí)均能采用微波爐烘干的方法帶回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步研究。

這個(gè)方法可為其他植物葉片保存提供參考。其他的分子試驗(yàn)?zāi)芊襁@么應(yīng)用，有待進(jìn)一步研究。