修 憲，馮彩霞，相會(huì)欣，孟 陽(yáng)，王 麗

0 引言

姜黃素(Curcumin)屬于天然酚類(lèi)色素，是從姜黃、莪術(shù)、郁金根莖中分離出的活性物質(zhì)之一[1]。研究表明，姜黃素在抗氧化、抗炎(神經(jīng)變性疾病、糖尿病、過(guò)敏、哮喘、支氣管炎、腸炎、風(fēng)濕病和牛皮癬)[2]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[3-4]、抗腫瘤[5-7]方面均表現(xiàn)出很好的藥理作用。姜黃素也具有抗增生、抗人類(lèi)免疫缺陷、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟和腎臟等功效。姜黃素易溶于甲醇、乙醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，微溶于苯和乙醚，不溶于水。由于姜黃素水溶性差，不能用于靜脈注射給藥，為解決這一問(wèn)題，本課題組將姜黃素制備成可用于注射給藥的脂質(zhì)體制劑。

已經(jīng)上市銷(xiāo)售的一些脂質(zhì)體制劑和小分子膠束制劑，例如鹽酸多柔比星脂質(zhì)體、兩性霉素B脂質(zhì)體、紫杉醇注射液及多西他賽注射液，能夠通過(guò)引起補(bǔ)體激活導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生，這種反應(yīng)稱(chēng)為補(bǔ)體激活相關(guān)的假性過(guò)敏反應(yīng)(Complement activation-related pseudo-allergic reactions，CARPA)。美國(guó)藥品監(jiān)管部門(mén)建議在藥物毒性檢測(cè)中增加體內(nèi)或體外補(bǔ)體活性檢測(cè)，來(lái)預(yù)測(cè)藥物制劑發(fā)生假性過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

為了預(yù)測(cè)姜黃素脂質(zhì)體是否會(huì)發(fā)生CARPA，比較不同批次(制備工藝相同，批量不同)姜黃素脂質(zhì)體免疫毒性的區(qū)別。我們建立了補(bǔ)體活化體外模型，并對(duì)姜黃素脂質(zhì)體進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，上海亞榮)；離心機(jī)(H1750，湖南湘儀)；渦旋混合器(Vortex3，IKA)；真空干燥箱(YZF-6050，上海姚氏儀器廠)；均質(zhì)機(jī)(LV1，Microfluidics)，多功能酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，Thermo)。姜黃素(石藥集團(tuán)，批號(hào)：150701A)；二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC，Lipoid公司，批號(hào)：L12113C)；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG，Lipoid公司，批號(hào)：L13105G)；人免疫球蛋白IgG(Sigma公司，批號(hào)：SLBR0560V)；酵母多糖Zymosan A(Sigma公司，批號(hào)：BCBK3273K)；人補(bǔ)體SC5b-9因子ELISA試劑盒(Quide公司，批號(hào):077713)；補(bǔ)體活性評(píng)價(jià)試劑盒Complement system Screen(EURO Diagnostica公司，批號(hào)：SS3434)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素脂質(zhì)體制備 稱(chēng)取姜黃素、DMPC、DMPG于圓底燒瓶中，量取甲醇、氯仿混合溶劑(1∶1)，避光攪拌或超聲使姜黃素完全溶解，形成近橙黃色透明溶液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓加熱除去有機(jī)溶劑，形成透明的橙黃色薄膜，避光30 ℃，30 mmHg真空干燥箱內(nèi)放置24 h。加入5%葡萄糖注射液50 ℃避光水化1 h，采用均質(zhì)機(jī)7 000 psi均質(zhì)至粒徑約為(115±10)nm，采用0.45 μm針頭濾器過(guò)濾后，再于無(wú)菌環(huán)境中采用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 補(bǔ)體活化體外模型

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清 本研究使用人血清進(jìn)行試驗(yàn)，為了避免血清樣本量小導(dǎo)致的不同批次檢測(cè)結(jié)果難以比較的問(wèn)題，血清采集自39例健康志愿者，血清采集前使志愿者充分了解血清采集目的，并簽署知情同意書(shū)，采集過(guò)程符合倫理要求。采集志愿者全血收集于真空玻璃促凝管內(nèi)，室溫放置0.5 h使其凝固，將促凝管置于離心機(jī)內(nèi)3 000 r/min離心5 min，收集上層血清，取每位志愿者血清200 μl置于離心管內(nèi)充分混勻后分裝作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，將分裝后的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清及剩余志愿者血清放置在-80 ℃條件下保存。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清 取-80 ℃條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，置37 ℃水浴中融化后置于冰上，加入人IgG(終濃度為1 mg/ml)和zymosan A(終濃度為10 mg/ml)，激活標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清中的補(bǔ)體成分后得到標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清[9]，用于不同批次檢測(cè)的相對(duì)定量。標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清制備完成后，分裝，放置在-80 ℃條件下保存。

2.2.3 姜黃素脂質(zhì)體作用下的體外補(bǔ)體激活 取-80 ℃條件下保存的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，置37 ℃水浴中融化后置于冰上，取融化的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，加入10 μl姜黃素脂質(zhì)體，置水浴振蕩中37 ℃孵育0.5 h，加入EDTA終止反應(yīng)完成體外補(bǔ)體激活，其中EDTA終濃度應(yīng)為20 mmol/L，完成補(bǔ)體激活的血清樣品置于冰上待檢。

2.2.4 補(bǔ)體活性檢測(cè) 使用ELISA試劑盒檢測(cè)激活后的血清樣品中的SC5b-9濃度。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的建議對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行稀釋后，加入到ELISA試劑盒對(duì)應(yīng)的孔中，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成后續(xù)操作，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度數(shù)值并計(jì)算補(bǔ)體濃度。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清補(bǔ)體活性進(jìn)行檢測(cè)[10]，通過(guò)檢測(cè)不同途徑中共同產(chǎn)物SC5b-9，來(lái)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清3條途徑的補(bǔ)體活性，結(jié)果經(jīng)典途徑、替代途徑和甘露聚糖結(jié)合凝集素途徑補(bǔ)體活性分別為76.4%、91.0%、97.8%。另外通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清經(jīng)過(guò)3次凍融后，SC5b-9含量變化不明顯；加入人IgG和zymosan A激活后，3次凍融的血清中SC5b-9含量均增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明本研究制備的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清在3次凍融后沒(méi)有失活或自發(fā)激活，用于補(bǔ)體體外活化是合適的，血清反復(fù)凍融次數(shù)≤3次對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響。

2.3 姜黃素脂質(zhì)體激活補(bǔ)體能力的檢測(cè) 按照“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)170301、170302、170303批次姜黃素脂質(zhì)體激活補(bǔ)體能力，將姜黃素脂質(zhì)體加入到標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清中，陽(yáng)性對(duì)照組(Positive control，PC組)為上述經(jīng)過(guò)人IgG和zymosan A激活的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照血清，陰性對(duì)照組(Negative control，NC組)為用5%葡萄糖溶液稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，通過(guò)檢測(cè)SC5b-9含量判斷姜黃素脂質(zhì)體能否激活補(bǔ)體以及不同批次姜黃素脂質(zhì)體激活補(bǔ)體能力的差別。SC5b-9含量結(jié)果用SPSS 19.0處理，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，見(jiàn)圖1。

圖1 經(jīng)姜黃素脂質(zhì)體激活后血清中SC5b-9含量

3 討論

應(yīng)用補(bǔ)體活化體外模型對(duì)姜黃素脂質(zhì)體激活補(bǔ)體能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，能夠快捷地檢測(cè)出藥物體外激活補(bǔ)體后血清中SC5b-9含量，結(jié)果與NC組比較，SC5b-9含量明顯升高；試驗(yàn)中3個(gè)批次姜黃素脂質(zhì)體制備工藝相同，批量不同，3個(gè)批次藥物激活補(bǔ)體后SC5b-9含量幾乎無(wú)差別，說(shuō)明課題組選取的制備工藝制備出不同批量(一定批量范圍內(nèi))批次的姜黃素脂質(zhì)體激活補(bǔ)體的能力相同；由于脂質(zhì)體制劑制備工藝較為復(fù)雜，生產(chǎn)批量可能會(huì)對(duì)制劑相關(guān)性質(zhì)產(chǎn)生影響，本研究結(jié)果能夠在批量放大方面提供一定理論支持；通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，可以比較不同檢測(cè)之間的結(jié)果，這為比較小試產(chǎn)品、中試產(chǎn)品以及相同批量不同批次產(chǎn)品免疫學(xué)毒性提供了一種方法。

本研究選用人血清而未選用相對(duì)容易獲得的動(dòng)物血清進(jìn)行試驗(yàn)。由于人與動(dòng)物補(bǔ)體系統(tǒng)存在差異，人血清與動(dòng)物血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在不一致，使用動(dòng)物血清參考價(jià)值有限；采用人血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，存在血清獲取難、不同檢測(cè)批次結(jié)果無(wú)法比較的問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清為多人的血清混合后而得，使得有足夠量的血清用于補(bǔ)體激活實(shí)驗(yàn)，同時(shí)避免了個(gè)體差異的影響；實(shí)驗(yàn)證實(shí)，經(jīng)過(guò)凍融的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清不會(huì)對(duì)補(bǔ)體激活造成影響，也就是說(shuō)每次實(shí)驗(yàn)使用相同的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)血清，并制備標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，這樣不同批次檢測(cè)結(jié)果也可以相互比較。

研究表明，藥物制劑激活血清中補(bǔ)體后，藥物組SC5b-9濃度較空白組增加超過(guò)300%時(shí)，發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高[11]。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，姜黃素脂質(zhì)體組SC5b-9濃度與NC組相比，增加了約330%，說(shuō)明本課題組制備的姜黃素脂質(zhì)體應(yīng)用于臨床時(shí)發(fā)生CARPA反應(yīng)的可能性較大，具體結(jié)果請(qǐng)關(guān)注課題組的后續(xù)研究。