王生成，楊祚明，蔡瀟陽，張素領(lǐng)，王曉峰

0 引言

銅綠假單胞菌(Paeudomonasaeruginosa，Pa)屬于非發(fā)酵菌假單胞菌屬，是醫(yī)院內(nèi)常見的條件致病菌之一，在呼吸科和ICU感染率高，常感染免疫力低下患者[1-5]。Pa對多種抗生素產(chǎn)生耐藥作用，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)，其臨床分離率僅次于大腸埃希菌[6]。Pa的耐藥機(jī)制復(fù)雜，外排泵系統(tǒng)在耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，目前發(fā)現(xiàn)的有7種外排泵系統(tǒng)。雖然目前研究者對外排泵系統(tǒng)的功能尚不完全清楚，但是已經(jīng)認(rèn)識到外排泵對Pa耐藥性的重要作用。有報道，外排泵可能通過將藥物泵出菌體外發(fā)揮耐藥作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，海南西部地區(qū)Pa的感染率較高，且其中4個外排系統(tǒng)MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM受到多種危險因素的調(diào)控[8-9]。由于檢測難度較大，我們參考上述文獻(xiàn)報道[8-9]對MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM 4個主動外排系統(tǒng)的表達(dá)情況及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床治療提供思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選取2016年9月至2018年10月儋州市人民醫(yī)院微生物培養(yǎng)室分離的Pa 54株，菌株均經(jīng)法國生物-梅里埃公司所產(chǎn)的VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)(BioMerieux)鑒定，其中多重耐藥(對2種或者2種以上抗生素耐藥)菌株36株，全部敏感菌株18株。參考菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922，對照株P(guān)a01，MexAB-OprM過度表達(dá)株CR1，MexXY過度表達(dá)株N135。

1.2 試劑和儀器 MH瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司，外排泵抑制劑苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺(Phe-Arg-β-naph，PA βN)購自Sigma公司，抗菌藥物美羅培南購自日本鹽義制藥株式會社，其余13種抗菌藥物均購自中國藥品生物制品檢定所；TRIzol試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國大連TAKARA公司，SYBR GreenPCR Master Mix試劑盒購自美國Bio-Rad公司，DNA提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，Tap DNA聚合酶購自BioStar公司。DU-650紫外分光光度計(jì)購自美國Beckman公司，HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱購自澳大利亞Corbett公司，低速高溫離心機(jī)、熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自北京六一儀器廠，ABI PRISM 3700測序儀。

1.3 抗菌藥物最低抑菌濃度(MIC)測定 按照CLSI 2014年規(guī)定的臨界標(biāo)準(zhǔn)判定每株P(guān)a對抗菌藥物的敏感性，瓊脂稀釋法測定14種抗菌藥物對Pa的MIC。干預(yù)實(shí)驗(yàn)測定耐藥菌株加外排泵抑制劑PA βN(終濃度為50 mg/L)對頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南的MIC。

1.4 Pa總RNA的提取 Pa單菌落接種于LB培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒說明書提取Pa總RNA。紫外分光光度計(jì)測定，記錄D260/280(RNA濃度)、D260/230(RNA純度)，根據(jù)測定值計(jì)算mRNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為30 ℃ 10 min，42 ℃ 30～50 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.5 RCR預(yù)實(shí)驗(yàn)測定 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加無酶ddH2O稀釋10倍作為預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)０暹M(jìn)行PCR反應(yīng)，Primer Premier 5.0進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因的16SrRNA引物設(shè)計(jì)，引物序列如表1所示，由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)使用HS Ex Tap酶，反應(yīng)條件設(shè)置為94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共進(jìn)行30個循環(huán)，20 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶單一產(chǎn)物表明反應(yīng)產(chǎn)物專一，無二聚體，可繼續(xù)用于RT-PCR。

1.6 RT-PCR檢測膜融合蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達(dá)水平 熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達(dá)水平，引物序列根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)如表1所示[10]，反應(yīng)體系為25 ml：Ultra SYBR Mixture 12.5 ml，cDNA 2.0 ml，上下游引物各0.5 ml，無RNA酶H2O 9.5 ml。SYBRGreen法熒光定量PCR參數(shù)設(shè)置為95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得半定量基因的表達(dá)量。

1.7 PCR擴(kuò)增調(diào)控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ及DNA測序 用煮沸法提取54株細(xì)菌的基因組DNA，分別擴(kuò)增其調(diào)控基因mexR、nfxb、mexT、mexZ[11]。PCR反應(yīng)體系為50 ml，PVR-magicMix 2.0 25 ml，DNA模板5，反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s,進(jìn)行30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，以純化后產(chǎn)物送上海生工科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果使用Blast與GenBank已知序列進(jìn)行比對，引物序列如表1所示。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物最低抑菌濃度的測定 54株P(guān)a中有36株為多重耐藥，18株為全部敏感株，對抗菌藥物的耐藥性、中介及敏感性如表2所示。其中耐藥性按照高低順序排列依次為：頭孢噻肟、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素、哌拉西林、環(huán)丙沙星、替卡西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、美羅培南、亞胺培南/西司他丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星。

表2 抗菌藥物耐藥性高低的比較

2.2 干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 瓊脂稀釋法測定在PA βN干預(yù)下36株多重耐藥菌株的MIC，中位數(shù)法表示各組MIC值，23株對頭孢噻肟的敏感性由64～512 g/ml提高到4～256 g/ml，31株對慶大霉素的敏感性由1～64 g/ml提高到0.25～32 g/ml，26株對環(huán)丙沙星的敏感性由4～256 g/ml提高到1～64 g/ml，對亞胺培南的MIC降低為原來的1/4。見表3。

表3 抗菌藥物耐藥性高低的比較

2.3 膜融合蛋白基因的mexA、mexC、mexE、mexX的mRNA表達(dá)水平 外排泵系統(tǒng)在野生菌中低表達(dá)，本研究選擇野生菌株P(guān)a01為參考，目的基因mexA、mexC、mexE、mexX的相對表達(dá)量高于參照株P(guān)a01的相對表達(dá)量(9 544、1 028、110.556、72.12)即為高表達(dá)菌株。對多重耐藥菌株進(jìn)行篩選，篩選出18株mexA高表達(dá)菌株，占總菌株數(shù)的33.33%(18/54)，篩選出9株mexC高表達(dá)菌株，占總菌株數(shù)的16.7%(9/54)，篩選出12株mexE高表達(dá)菌株，占總菌株數(shù)的22.22%(12/54)，篩選出14株mexX高表達(dá)菌株，占總菌株數(shù)的25.92%(14/54)；即18株P(guān)a高表達(dá)MexAB-OprM外排系統(tǒng)，9株P(guān)a高表達(dá)MexCD-OprJ外排系統(tǒng)，12株P(guān)a高表達(dá)MexEF-OprN外排系統(tǒng)，14株P(guān)a高表達(dá)MexXY-OprM外排系統(tǒng)。6株主動外排泵系統(tǒng)檢測陰性株，均無mexA、mexC、mexE、mexX的高表達(dá)。30株主動外排泵檢測陽性株及6株主動外排泵系統(tǒng)檢測陰性株的篩選試驗(yàn)及基因表達(dá)水平結(jié)果如表4所示。

2.4 外排泵系統(tǒng)在多重耐藥Pa中的作用 瓊脂稀釋法測定加入抑制劑的Pa菌株對頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南的敏感性，18株MexAB-OprM外排泵高表達(dá)Pa株與低表達(dá)Pa株比較，對頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星的MIC為2～64 μg/ml，9株MexCD-OprJ高表達(dá)株中6株對頭孢噻肟的敏感性MIC為2～128 mg/ml，12株MexEF-OprN中對環(huán)丙沙星、亞胺培南的敏感性MIC為4～128 mg/ml，14株MexXY-OprM為慶大霉素、環(huán)丙沙星高度耐藥菌株。

表4 36株P(guān)a 4種泵出系統(tǒng)的表達(dá)情況及外排泵篩選試驗(yàn)結(jié)果

2.5 mexR、nfxB、mexT、mexZ序列分析 分別隨機(jī)選擇mexA、mexC、mexE、mexX高表達(dá)菌株中的4個菌株，提取基因組DNA擴(kuò)增其調(diào)控基因mexR、nfxB、mexT、mexZ，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化測序，并與GenBank中多對應(yīng)序列進(jìn)行對比。mexR高表達(dá)菌株中3個發(fā)生mexR基因突變，分別為第661位、第670位、第688位，第665位mexR編碼提前終止；4個nfxB高表達(dá)菌株中均發(fā)生82位的突變；4個mexT高表達(dá)菌株中均發(fā)生26位的突變；4個mexZ高表達(dá)菌株中2個發(fā)生138位的突變，一個發(fā)生50位的突變。突變結(jié)果如表5所示。

注：Ser：絲氨酸，serine；Gly：甘氨酸，glycine；Val：纈氨酸，valine；Gln：谷氨酰胺，glutamine；Asn：天冬酰胺，asparagine；Arg：精氨酸，agrinine；Leu：亮氨酸，leucine；His：組氨酸，histidine

3 討論

Pa中4個主動外排系統(tǒng)為MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM[11-12]，外排系統(tǒng)的作用主要依賴細(xì)胞膜上的主動外排蛋白，主要包括連接膜與相關(guān)外排蛋白的膜連接蛋白MexA、MexC、MexE、MexX，轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素作用的蛋白MexB、MexD、MexF、MexY，控制抗生素出入的外膜通道蛋白OprM、OprJ、OprN、Opr4。Pa的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，研究顯示，外排泵系統(tǒng)在耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用，MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM外排泵系統(tǒng)均為RND家族，均由外膜蛋白、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、膜融合蛋白3部分組成。目前所涉及的耐藥機(jī)制主要有以下幾個方面：①外膜蛋白OprM等形成門通道，引起菌體包膜的通透性改變，使藥物排出菌體外；②內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體MexB、MexD等可識別藥物并將藥物主動排出細(xì)胞膜；③膜融合蛋白MexA、MexC等位于內(nèi)外膜中間，連接內(nèi)外膜。3種蛋白連接在一起形成一個連續(xù)通道，使進(jìn)入菌體內(nèi)的抗菌藥物從菌體內(nèi)排除，藥物因達(dá)不到有效濃度而失效，且菌體對該種藥物產(chǎn)生耐藥性[13-15]。外排泵系統(tǒng)中的任何一部分失活都會引起菌株敏感性的提高[16]。

外排泵抑制劑具有抑制外排泵活性、減少細(xì)菌外排、提高抗菌藥物敏感性的作用。PA βN是一個低分子多肽，具有抑制外排泵表達(dá)的作用，還能夠降低Pa的侵襲性[17]。Coban等[18]研究表明，PA βN在16 mg/ml時，可以顯著降低對喹諾酮類耐藥的Pa對環(huán)丙沙星的MIC。本研究采用瓊脂稀釋法測定應(yīng)用外排泵抑制劑Pa對抗菌藥物的MIC的改變。結(jié)果顯示，Pa對頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星3種藥物的MIC均降低，表明添加抑制劑后可以降低外排泵的活性，提高菌體內(nèi)藥物的有效濃度。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，外排泵mRNA的表達(dá)水平可以反映蛋白表達(dá)水平[19]。故本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR檢測4種外排系統(tǒng)中膜連接蛋白mexA、mexC、mexE、mexX的表達(dá)，結(jié)果顯示，36株多重耐藥菌株的mRNA表達(dá)水平均有所提高，且多個菌種表達(dá)不止一種外排泵系統(tǒng)，表明這些耐藥菌株的多重耐藥性可能是外排泵過度表達(dá)引起的。加入外排泵抑制劑后，可以發(fā)現(xiàn)耐藥菌株對頭孢噻肟、慶大霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南的MIC均有所下降，進(jìn)一步證實(shí)抑制外排泵系統(tǒng)的活性可以降低Pa的MIC。

研究發(fā)現(xiàn)，外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)受到上游調(diào)控基因的影響，基因的突變導(dǎo)致外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)[20]。有報道，外排系統(tǒng)mexR編碼的MexR蛋白與MexAB-OprM的增強(qiáng)子結(jié)合，起到轉(zhuǎn)錄抑制的作用[21]。Nabl突變株中，mexR突變導(dǎo)致MexAB-OprM失去抑制表達(dá)增加，耐藥性增強(qiáng)[22]。本研究結(jié)果顯示，4個mexA高表達(dá)菌株中3個發(fā)生mexR基因突變；mexC高表達(dá)菌株中均發(fā)生nfxB的突變，mexE高表達(dá)菌株中均發(fā)生mexT的突變，mexX高表達(dá)菌株中3個發(fā)生mexZ的突變，表明外排泵系統(tǒng)的過度表達(dá)是受到調(diào)控基因突變的影響，引起氨基酸的變化，進(jìn)而引起蛋白的變化。

綜上所述，多重耐藥Pa的MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM的過度表達(dá)是引起Pa多重耐藥的主導(dǎo)，且外排系統(tǒng)受到相應(yīng)調(diào)控基因的影響。本研究尚存在不足之處，對每個外排系統(tǒng)的具體分子作用機(jī)制尚未研究清楚。