盧永申，魏 明

0 引言

細(xì)胞內(nèi)與心腦血管以及神經(jīng)信號(hào)傳遞有關(guān)的物質(zhì)中，一氧化氮(NO)占有相當(dāng)重要的地位[1-3]，但在機(jī)體的炎性病變過程中，高負(fù)荷的NO能夠使身體機(jī)能遭受到較大的損傷，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體內(nèi)積聚過多的NO時(shí)，其線粒體的功能損傷，同時(shí)，細(xì)胞自行凋亡[4-5]。在嚴(yán)重?cái)⊙Y中，過量的NO可以使細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷[6]。誘導(dǎo)型的一氧化氮合酶(iNOS)能夠促進(jìn)高濃度的NO產(chǎn)生，生成的高濃度NO可以與超氧陰離子相互作用產(chǎn)生過氧化亞硝基陰離子，從而使細(xì)胞中的脂類物質(zhì)過度氧化、蛋白質(zhì)的酪氨酸發(fā)生硝基化及巰基氧化等，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)多類炎性病變的產(chǎn)生[7]，所以，嚴(yán)格把控機(jī)體內(nèi)NO的含量對(duì)避免NO造成的毒性傷害有至關(guān)重要的作用。STAT5通路抑制劑是一種多巴胺受體的拮抗劑，在臨床治療上多用于精神分裂癥患者。在2011年，Nelson等[8]首次提出，其作為STAT5通路的抑制劑，具有治療慢性髓系白血病的藥效?；诖耍覀兺茰y(cè)STAT5通路抑制劑對(duì)巨噬細(xì)胞iNOS的表達(dá)也可能有調(diào)節(jié)的作用。本實(shí)驗(yàn)用脂多糖(LPS)使小鼠巨噬細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)，從而構(gòu)建模型[9]，以STAT5通路抑制劑為工具藥物來探究STAT5通路對(duì)iNOS表達(dá)的內(nèi)在調(diào)節(jié)效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 藥品、試劑以及主要儀器 STAT5通路抑制劑對(duì)照品以及LPS均購自Sigma公司(America)，雙抗、DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清購自Gibco公司(America)，總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green qPCR Super Mix-UDG kit試劑購自大連寶生物工程公司，Griess檢測(cè)試劑盒、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、蛋白質(zhì)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)試劑盒和羊抗兔的二抗均購自碧云天生物公司，磷酸化STAT5(p-STAT5)和總量STAT5單抗購自Bioworld公司(America)，iNOS和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單抗購自Cell Signaling Technology公司(America)。實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)儀ABI 7500型，購自America Applied Biosystems公司,多功能酶標(biāo)儀購自America Bio-Rad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 使用帶有雙抗(100 μg/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素)以及10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培育RAW264.7細(xì)胞，然后將其放于5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱里恒溫培養(yǎng)，當(dāng)其孵育到融合度達(dá)到70%～80%之后開始傳代培養(yǎng)。

1.4 MTT方法測(cè)定細(xì)胞活性 將對(duì)數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞按照104個(gè)/孔接種到96孔板中，細(xì)胞貼壁過夜，分別加入0、2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5通路抑制劑反應(yīng)24 h后，單孔中加入20 μl MTT液(5 mg/ml)，于37 ℃下培養(yǎng)4 h，除去板中的營養(yǎng)液，給予150 μl二甲基亞砜(DMSO)，將細(xì)胞放在搖床上搖動(dòng)10 min使結(jié)晶物質(zhì)完全溶解，之后用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測(cè)定光密度(OD)。

1.5 Griess方法測(cè)定細(xì)胞中NO的含量 參照文獻(xiàn)[9-10]將對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞用2×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板上，細(xì)胞貼壁過夜，分別設(shè)為空白對(duì)照組、STAT5通路抑制劑(10 μmol/L)對(duì)照組(STAT5通路抑制劑對(duì)照組)、LPS誘導(dǎo)(LPS 1 μg/ml)組(LPS誘導(dǎo)組)，其中LPS誘導(dǎo)組分為4個(gè)亞組[1 μg/ml LPS誘導(dǎo)組(LPS誘導(dǎo)組)、1 μg/ml LPS+2.5 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組低濃度組)、1 μg/ml LPS+5 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組中濃度組)、1 μg/ml LPS+10 μmol/L STAT5通路抑制劑組(STAT5通路抑制劑組高濃度組)]，在LPS誘導(dǎo)前30 min使用STAT5通路抑制劑進(jìn)行處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定各組培養(yǎng)上清液的NO含量。按照公式計(jì)算NO抑制率。

1.6 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中iNOS mRNA的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度種到6孔板里，細(xì)胞貼壁生長過夜，按照“1.5”項(xiàng)方法分別進(jìn)行分組以及給藥。放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h之后，用Trizol方法提取細(xì)胞總量RNA，然后將提取出的RNA進(jìn)行定量后用逆轉(zhuǎn)錄方法取得cDNA。用RT-PCR儀操作qPCR。由上海英濰捷基公司進(jìn)行引物制作，iNOS上游的引物序列：5′-TCCATGACTCCCAGCACA-3′，下游的序列：5′-CCATCTCCTGCATTTCTTCC-3′，長度557 bp；GAPDH上游的序列：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游的序列：5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，長度107 bp。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后以溶解曲線判定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性效果。數(shù)據(jù)均應(yīng)用相對(duì)定量的ΔΔCt方法來處理，使用iNOS mRNA/GAPDH作為評(píng)價(jià)方法，同時(shí)計(jì)算出iNOS mRNA的抑制率。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中iNOS、STAT5以及p-STAT5蛋白表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞按照“1.6”項(xiàng)的接種方法接種培養(yǎng)，同時(shí)按照“1.5”項(xiàng)方法分別進(jìn)行分組以及給藥。采用蛋白提取試劑盒的方法提取每組細(xì)胞中總蛋白，用BCA蛋白定量法檢測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的量。用20～50 μg的總蛋白加入上樣緩沖液加熱至沸騰后，進(jìn)行SDS-PAGE的電泳，用半干轉(zhuǎn)法把膠條中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉于25 ℃下封閉1 h，用封閉液將相對(duì)應(yīng)的一抗進(jìn)行稀釋，同時(shí)反應(yīng)1 h，洗膜之后添加用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，于25 ℃下培養(yǎng)1 h，洗膜之后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒進(jìn)行發(fā)光操作，X片曝光成像。應(yīng)用凝膠分析軟件算出壓片條帶的灰度值，以iNOS/GAPDH、p-STAT5/STAT5計(jì)算各個(gè)組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的作用 0、2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5通路抑制劑和/或1 μg/ml LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT5通路抑制劑和/或LPS均不影響細(xì)胞活性(P>0.05)，表明STAT5通路抑制劑和/或LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)，見表1。因此，本研究以下使用的STAT5通路抑制劑對(duì)照為10 μmol/L，LPS為1 μg/ml。

2.2 STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NO產(chǎn)生和釋放的作用 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組、STAT5通路抑制劑對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組以及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組細(xì)胞中NO的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.69，P<0.05)；低、中、高濃度STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞中釋放NO的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=132.49，P<0.05)。相較于空白對(duì)照組，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中NO的量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS誘導(dǎo)組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細(xì)胞中NO含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖1。

表1 STAT5通路抑制劑或/和脂多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響(n=3)

圖1 STAT5通路抑制劑對(duì)細(xì)胞中NO釋放量的影響

注：A.空白對(duì)照組；B.STAT5通路抑制劑對(duì)照組；C.LPS誘導(dǎo)組；D.STAT5通路抑制劑低濃度組；E. STAT5通路抑制劑中濃度組；F. STAT5通路抑制劑高濃度組(下同)。與空白對(duì)照組比較，#P<0.05

表2 STAT5通路抑制劑對(duì)細(xì)胞中NO釋放量的影響(n=3)

注：*與空白對(duì)照組比較;#與LPS誘導(dǎo)組比較

2.3 STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞中iNOS mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)的作用 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組、STAT5通路抑制劑對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組細(xì)胞中內(nèi)iNOS mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=123.59、23.37，P<0.05)；與空白對(duì)照組比較，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞iNOS mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS誘導(dǎo)組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細(xì)胞iNOS mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞中iNOS mRNA表達(dá)

圖3 各組細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞中iNOS mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)(n=3)

組別iNOS mRNA/GAPDHt值*P值*iNOS蛋白/GAPDHt值*P值*空白對(duì)照組1.00±0.001.00±0.00STAT5通路抑制劑對(duì)照組1.04±0.090.93>0.051.01±0.030.91>0.05LPS誘導(dǎo)組100.01±23.3489.26<0.0512.07±3.1212.54<0.05STAT5通路抑制劑低濃度組83.27±15.9868.37<0.059.15±2.018.76<0.05STAT5通路抑制劑中濃度組59.84±5.6748.76<0.058.15±1.897.28<0.05STAT5通路抑制劑高濃度組44.25±6.2933.48<0.054.26±1.295.12<0.05F值123.5932.37P值<0.05<0.05

注：*與空白對(duì)照比較

2.4 STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)p-STAT5/STAT5的作用 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，空白對(duì)照組、STAT5通路抑制劑對(duì)照組、LPS誘導(dǎo)組以及STAT5通路抑制劑低、中、高濃度組的細(xì)胞內(nèi)p-STAT5/STAT5表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.07，P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞的p-STAT5/STAT5顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS誘導(dǎo)組比較，STAT5通路抑制劑中、高濃度組細(xì)胞的p-STAT5/STAT5明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖4。

圖4 各組細(xì)胞中p-STAT5/STAT5蛋白表達(dá)

表4 STAT5通路抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)p-STAT5/STAT5蛋白的作用(n=3)

注：*與空白對(duì)照組比較

3 討論

應(yīng)對(duì)外界的多種創(chuàng)傷性刺激，滿足機(jī)體自我防護(hù)的復(fù)雜防御過程是炎癥的本質(zhì)特征。而巨噬細(xì)胞在炎癥發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過程中都發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用。一方面通過抗原識(shí)別和遞呈激活免疫系統(tǒng)，還可以產(chǎn)生許多炎性物質(zhì)介導(dǎo)大范圍的炎癥級(jí)聯(lián)過程。在炎癥的發(fā)展過程中，NO作為一種重要的炎癥因子發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)表明，敲除相應(yīng)的基因或采用藥物干預(yù)治療等方法阻礙NO的合成能夠顯著緩解患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的炎癥病變[11-12]。

大部分的細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄受到抑制是由于在轉(zhuǎn)錄因子的激活過程中一個(gè)或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子被阻斷造成的[13-14]。為了探討STAT5抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響，本實(shí)驗(yàn)以2.5、5.0、10 μmol/L的STAT5抑制劑和/或1 μg/ml LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)STAT5抑制劑和/或LPS均不影響細(xì)胞活性，表明STAT5抑制劑和/或LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性反應(yīng)。為判斷STAT5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)iNOS的表達(dá)能否產(chǎn)生調(diào)節(jié)效果，我們檢測(cè)了STAT5通路抑制劑對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)和NO釋放量的作用。本研究結(jié)果顯示，STAT5通路抑制劑在2.5～10 μmol/L的線性范圍中能夠通過調(diào)節(jié)藥物的劑量來阻礙LPS誘導(dǎo)的iNOS蛋白質(zhì)及其mRNA的表達(dá)，以及RAW264.7細(xì)胞內(nèi)NO的產(chǎn)生與釋放。同時(shí)也探究了STAT5通路抑制劑對(duì)p-STAT5蛋白表達(dá)的作用。研究表明，p-STAT5蛋白在受到LPS刺激3 h之后到達(dá)峰值[15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，STAT5通路抑制劑降低了由LPS誘導(dǎo)的p-STAT5蛋白質(zhì)的表達(dá)量，但MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，上述STAT5通路抑制劑的抑制性效果是由于其自身藥效的活性作用，并非通過細(xì)胞毒作用實(shí)現(xiàn)的。所以我們推測(cè)STAT5通路抑制劑降低NO的產(chǎn)出量可能成為其對(duì)STAT5通路抑制效果的最好解釋。

綜上，STAT5通路抑制劑能夠阻礙經(jīng)LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而降低NO的產(chǎn)出量。對(duì)于經(jīng)NO介導(dǎo)的炎性病變的臨床治療，減少p-STAT5蛋白質(zhì)的表達(dá)量可能是一個(gè)新的治療策略。