顧冬雪，谷 秀，張雪云

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以慢性氣道炎癥為本質(zhì)的慢性氣道疾病，表現(xiàn)為不完全可逆的氣流受限，嚴(yán)重者伴有呼吸衰竭，乃至死亡。近年來COPD的發(fā)病率不斷增加，其發(fā)病機制十分復(fù)雜，確切病因不清楚，因目前還沒有特效藥物能遏制其病情的進行性發(fā)展，亟待尋找有效的可逆轉(zhuǎn)病情的治療藥物。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床中較為常用的抗感染藥物，但目前諸多研究闡明了該類藥物的抗感染之外的抗炎作用，尤其是作用于慢性氣道性疾病，如彌漫性泛細(xì)支氣管炎等[1]；目前亦有研究顯示了其在COPD中的抗炎作用[2]，筆者前期的研究顯示，小劑量紅霉素可通過MAPK途徑抑制煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺氣腫的形成[3]。但目前對于紅霉素作用于肺氣腫形成及發(fā)展的機制尚未完全明確。低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是機體在低氧等條件下產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子，維持著體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)，可調(diào)控與血管生成、糖代謝、細(xì)胞增殖等相關(guān)的多種基因表達[4]。近年來，國外對HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系[5]，諸多研究顯示，HIF-1α可能參與了炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。本文通過香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠慢性氣道炎癥模型，給予紅霉素干預(yù)后，觀察HIF-1α的改變及其機制。

1 研究方法

1.1 動物模型的制備 所有實驗均按照中國醫(yī)科大學(xué)動物研究倫理委員會的指導(dǎo)進行。從中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心獲得雄性Wistar大鼠[9～10周齡，(200±18)g]，在SPF飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗動物于實驗前1周開始飼養(yǎng)。大鼠分籠(每籠10只)飼養(yǎng)，室溫維持在23～26 ℃左右，飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食及飲水，室內(nèi)光線12 h規(guī)則變化。大鼠隨機分為3組,每組8只：正常對照組(C組),香煙煙霧模型組(CS組),紅霉素+香煙煙霧模型(ERY+CS組)。CS組大鼠暴露于16支香煙(萬寶路;美國紐約州;每支香煙中含有0.9 mg尼古丁，14 mg一氧化碳和12 mg焦油)煙霧中;煙霧鏡v/V%為8%)，每天2次，每周6 d，共12周，每次30 min，然后將濾網(wǎng)移除。ERY+CS組大鼠暴露于CS 12周，每天口服1次ERY(Sigma-Aldrich；Merck，德國)灌胃，劑量為100 mg/kg。從12周暴露期的第1天開始，在香煙煙霧暴露前0.5 h進行藥物治療。對照組每天鹽水作為對照灌胃。每天觀察各組大鼠被毛、活動性、飲食、咳嗽等一般情況。在第12周結(jié)束時，在麻醉下[40 mg/kg戊巴比妥(Sigma-Aldrich；Merck，德國)]腹腔注射后放血處死大鼠，分離肺組織。取右葉保存于-80 ℃。大鼠肺的左葉(未灌洗)在含5 mM CaCl2+1 mM MgCl2的冰冷鹽水中短暫洗滌，中性甲醛固定。通過結(jié)扎右主支氣管，對大鼠進行左側(cè)單側(cè)肺灌洗，每次2 ml生理鹽水，灌洗肺泡3次后回抽放入EP管中，再抽取生理鹽水2 ml重復(fù)上述動作2次，每次灌洗后立即回吸，反復(fù)共3次，最終的回收量約為4.5 ml肺泡灌洗液(BALF)(回收率約75%)，將所有回吸液置于10 ml EP管中，立即進行離心，1 000 r/min，離心10 min，留取上清液，棄去細(xì)胞沉渣。分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病理學(xué)評估 肺組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度為4 μm。切片后經(jīng)脫蠟，梯度酒精復(fù)水，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。計算標(biāo)本平均肺泡數(shù)(MAN)及肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)：每組選取3只典型大鼠進行病理切片及HE染色，每張切片隨機鏡檢3個視野，在視野中心劃十字交叉線，計算劃線總長(L)、測量的視野面積(S)、計數(shù)與交叉線相交的肺泡隔數(shù)(NS)，以及計數(shù)各視野的肺泡總數(shù)(Na)，平均肺泡數(shù)MAN=Na/S；平均內(nèi)襯間隔MLI=L/NS，表示肺泡平均內(nèi)徑；二者用于測量大鼠肺氣腫的病理學(xué)嚴(yán)重程度。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定BALF中TNF-α及IL-8含量 按照ELISA試劑盒的說明進行操作，測定BALF中TNF-α及IL-8的含量。

1.4 免疫組化及Western檢測肺組織HIF-1α的表達 免疫組化染色按S-P試劑盒說明進行。右肺上葉用RIPA緩沖液(CST，馬薩諸塞州，美國)以100 mg組織∶1 ml裂解緩沖液的比例溶解。隨后4 ℃離心，條件為1 500×g，20 min。定蛋白后等量上樣，SDS-PAGE分離，隨后通過電印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在室溫下用封閉緩沖液[含0.1%Tween-20的3%脫脂牛奶在TBS(pH 7.4)]中封閉1 h，隨后在4 ℃下與抗HIF-Aα或β-actin的抗體孵育過夜，洗膜后二抗孵育2 h，使用Enhanced Chemiluminescence Plus試劑盒，并使用Las-3000發(fā)光圖像分析儀(Fujifilm，日本東京)進行分析。使用Image J軟件對條帶強度進行定量。相對于對照組中的水平計算蛋白質(zhì)表達的倍數(shù)變化。

1.5 大鼠肺功能測定 依據(jù)文獻描述[6]測定0.3 s用力呼氣量(FEV0.3)以及0.3 s用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV0.3/FVC)。給予大鼠10%水合氯醛麻醉后，暴露氣管，置入Y型導(dǎo)管，描記大鼠平靜呼吸，在1次呼氣末注射6 ml空氣后，快速脫開，記錄FEV0.3及FEV0.3/FVC。

2 結(jié)果

2.1 病理形態(tài)學(xué)改變 在大體標(biāo)本中，與C組相比較，CS組大鼠肺體積明顯增大，表面蒼白，局部可見肺大皰。使用紅霉素干預(yù)后，肺部肺氣腫改變明顯好轉(zhuǎn)(圖1A～圖1C)。

對比顯微鏡下病理學(xué)改變可見，與C組相對比，CS組大鼠氣道黏膜纖毛上皮倒伏，有不同程度的脫落，氣道被膜下腺體增生、肥大，杯狀細(xì)胞增多以及黏膜上皮形態(tài)改變，由柱狀逐漸扁平化，出現(xiàn)局部鱗狀上皮化生。肺內(nèi)氣道壁及小血管周圍肺泡區(qū)周圍有炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡管、肺泡囊及肺泡明顯擴大，肺泡壁可見斷裂。ERY+CS組可見肺氣腫形態(tài)的改善(圖1D～圖1I)。各組間MLI及MAN改變?nèi)鐖D1G～圖1H所示。與C組相比，CS組MLI及MAN均明顯擴大(P<0.05)；與CS組相比，ERY+CS組MLI及MAN均明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)。

圖1 紅霉素對香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺氣腫改變的影響

2.2 BALF中TNF-α、IL-8蛋白的表達及大鼠肺功能結(jié)果 與C組比較，CS組大鼠BALF中炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-8表達均明顯增高(P<0.01)；經(jīng)紅霉素干預(yù)后，炎癥介質(zhì)TNF-α及IL-8表達有所降低(P<0.01)，見圖2A～圖2B。香煙煙霧暴露后，大鼠肺功能呈現(xiàn)明顯的阻塞性通氣功能障礙，F(xiàn)EV0.3及FEV0.3/FVC均降低(P<0.01)；經(jīng)紅霉素干預(yù)治療后，大鼠肺功能明顯改善(P<0.01)，見圖2C～圖2D。

圖2 紅霉素對香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠肺功能及BALF中炎癥介質(zhì)表達的影響

2.3 HIF-1α表達結(jié)果 免疫組化及Western blot結(jié)果表明，香煙煙霧誘導(dǎo)后；大鼠肺氣腫組織中HIF-α蛋白表達均明顯增高(P<0.01)；紅霉素干預(yù)后，香煙煙霧誘導(dǎo)的HIF-α的增高較前降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 紅霉素對香煙煙霧誘導(dǎo)大鼠HIF-1α表達的影響

3 討論

HIF-1是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1由條件性表達的HIF-1α和結(jié)構(gòu)性表達的HIF-1β兩個亞基組成，HIF-1α是其活性亞基，對氧分壓較敏感，正常氧分壓環(huán)境中HIF-1α極不穩(wěn)定，容易降解，難以檢測[7]。低氧環(huán)境下，脯氨酸羥化酶活性被抑制，HIF-1α降解被抑制，從而轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，與HIF-1β形成HIF-1分子，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用來調(diào)節(jié)靶基因表達[7]。

近年來國外對HIF-1α的研究顯示，其與炎癥反應(yīng)有密切的聯(lián)系，機體乏氧后注射LPS，大鼠肺泡內(nèi)間隔中性粒細(xì)胞數(shù)增高，炎癥反應(yīng)更為明顯，LPS給藥6 h后，肝臟HIF-1α表達增加，3 h后血清IL-1β和CRP水平升高[8]。本實驗結(jié)果顯示，煙熏誘導(dǎo)肺氣腫模型大鼠肺組織中HIF-1α蛋白表達呈陽性，其表達水平與TNF-α呈正相關(guān)，與大鼠肺功能呈負(fù)相關(guān)，提示在煙霧暴露下也可使HIF-1α表達，HIF-1α可能參與了COPD慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展。與本研究結(jié)果相似，一項研究對比了COPD及非COPD患者的肺組織，COPD患者的肺組織中HIF-1α表達增加，且與VEGF及其受體的表達呈正相關(guān)[9]。另外，HIF-1α的表達增加反映了COPD的嚴(yán)重程度[9]。通過檢測患者BALF中HIF-1α、EGFR及炎癥因子的表達以及細(xì)胞的體外實驗發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在COPD中過表達，通過激活EGFR/PI3K/AKT途徑上調(diào)了炎癥因子的表達[10]。COPD的肺部炎癥誘導(dǎo)激活的EGFR/PI3K/AKT通路進一步上調(diào)了反饋環(huán)中的HIF-1α表達，從而加劇了COPD的病理變化[10]。

迄今為止，多項基于大環(huán)內(nèi)酯類藥物應(yīng)用于COPD患者的研究均顯示，大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療可顯著減輕病情，可能有助于減輕這一群體的疾病負(fù)擔(dān)[11-13]。此外，與其他藥物共同使用時，紅霉素可以通過抑制PI3K/AKT途徑和增強HDAC2的活性來增強COPD模型大鼠中布地奈德的抗炎活性[14]。鑒于此，本研究對比分析了煙霧暴露后的大鼠肺氣腫經(jīng)紅霉素干預(yù)后的效果及潛在機制。結(jié)果表明，應(yīng)用紅霉素口服治療后，大鼠肺功能、肺部炎癥介質(zhì)以及氣腫病理改變均得到改善，由香煙煙霧所誘導(dǎo)的HIF-1α增高也得到抑制，從而對肺部的炎癥及損傷起到保護性作用，且可能通過HIF-1α調(diào)控了相應(yīng)的靶基因表達，從而發(fā)揮保護性作用。

綜上，小劑量紅霉素可通過調(diào)控抑制肺部HIF-1α的表達，從而發(fā)揮對香煙煙霧誘導(dǎo)的肺氣腫的保護性作用，進而改善患者的肺部炎癥反應(yīng)，改善肺功能，發(fā)揮抗炎作用。