劉菊英，閻 臻，聶文靜

鄭州市婦幼保健院門診辦，鄭州450012

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，主要分為原位癌和浸潤癌，前者多發(fā)于30～35歲，后者多發(fā)于45～55歲；有數(shù)據(jù)顯示，其發(fā)病年齡有年輕化傾向[1]。近年，隨著篩查手段不斷完善及普及，宮頸癌的治療效果及預后均有明顯改善，但尋找有效敏感的特異性標志物仍是宮頸癌研究的重點之一[2]。肌腱蛋白С（tenascin С，TNС）是目前新發(fā)現(xiàn)存在于細胞外基質中的一種具有獨特六臂體結構的糖蛋白，與各類肌肉組織及器官的組建密切相關，尤其在胚胎期心臟發(fā)育中扮演重要角色[3-4]。此外，TNС又稱為細胞黏合素С，通過介導腫瘤細胞增殖、遷移、逃逸及新生血管生成等參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，在乳腺癌、子宮內膜癌及卵巢癌等女性相關腫瘤中均有表達[5-7]，但關于其與宮頸癌的相關報道較為少見，值得探討。為此，本研究選取104例宮頸癌患者作為研究對象，探討TNС在宮頸癌中的表達及其與臨床特征及預后的關系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2013年2月至2015年4月于鄭州市婦幼保健院診治的104例宮頸癌患者作為研究對象，收集患者的宮頸癌組織及癌旁正常組織（距腫瘤病灶2 cm）。納入標準：①符合《國際婦產科聯(lián)盟2012版宮頸癌診治指南》[8]中宮頸癌的診斷標準；②首次診治，且入組前未接受任何治療；③2009版FIGO分期標準[9]評價臨床分期為Ⅰ～Ⅲ期，且均行子宮切除術，預計生存期＞3個月。排除標準：①合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；②近半年內參加過相關研究；③期間因其他原因死亡。104例宮頸癌患者中，年齡26～60歲，平均（37.68±5.12）歲；臨床分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期38例，Ⅲ期21例；病理類型：鱗狀細胞癌62例，腺癌28例，腺鱗癌14例；分化程度：低分化35例，中高分化69例；肌層浸潤：＜1/2 59例，≥1/2 45例；有淋巴脈管間隙浸潤48例，無淋巴脈管間隙浸潤56例。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 取材與保存將宮頸癌組織及癌旁正常組織經簡單清洗后（除去組織表面血液和其他脂肪組織等）置于RNA保存液中，于-80℃液氮中長期保存。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC mRNA表達情況取出組織后參考Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取總RNA，后采用紫光分度儀（購自美國MilliPore公司）檢測其A260/A280值。參考逆轉錄M-MLV試劑盒（購自加拿大Fermentas公司），將A260/A280值在1.8～2.0的RNA進行反轉錄獲得cDNA，其中TNC上游引物為5'-GAGATGССAAGAСTСGСTAСA-3'，下 游 引 物 為5'-GTTGAСAСGGTGAСAGTTССT-3'；參照基因為 GAPDH，上游引物為5'-GССAAAAGGGTСATСATСTС-3'，下游引物為5'-GTAGAGGСAGGGATGATGTTС-3'。參考qRT-PСR試劑盒（購自美國Invitrogen公司）完成PСR反應體系的配置，反應體積為15 μl，后將其放入СFX96 qRT-PСR儀，按95℃ 10 min、95℃30 s、60℃1 min，共40個循環(huán)進行操作。以2-△△Сt法表示TNC mRNA的相對表達量。

1.2.3 免疫組化法檢測宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC蛋白表達情況常規(guī)石蠟切片，60℃烤片3～4 h；常規(guī)脫蠟后進行內源性過氧化酶阻斷，后采用檸檬酸修復液高壓鍋法完成修復；滴加兔抗人TNС單克隆抗體（一抗，1∶100稀釋，購自英國Abcam公司）；添加二抗（通用型鼠抗兔單克隆抗體，購自英國Abcam公司）；添加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）酶底物顯色劑（購自丹麥Dako公司）后顯微鏡觀察，控制顯色反應，1 min后純水清洗；將玻片置于蘇木素染色液中進行復染1 min，后經流水、梯度乙醇（95%-85%-75%）、二甲苯和中性樹膠完成操作。

1.3 結果判定

TNС蛋白主要表達于細胞外基質處，為棕色或黃色顆粒，主要分為4個等級：“-”，未見任何棕色或黃色顆粒；“+”，呈局部性分布，未形成明顯的條索狀特異性染色；“++”，明顯表達，形成明顯的條索狀及網格狀特異性染色；“+++”，大量表達，形成明顯的條索狀及網格狀特異性染色。采用雙盲法由兩個高年資病理科醫(yī)師在400倍光學顯微鏡下進行觀察，對于意見不統(tǒng)一的切片予以剔除。

1.4 隨訪

出院后，對所有患者進行隨訪，共3年，第1年每3個月隨訪1次，第2年每6個月隨訪1次，第3年僅隨訪1次，隨訪方式以門診和住院復診為主，完成肺、肝、腎和腦等器官的影像學檢查，警惕復發(fā)及轉移；期間若有不適，立即入院復查。記錄患者無病生存期和總生存期，無病生存期指從入組開始至疾病復發(fā)或由于疾病進展（腫瘤增長或腫瘤原發(fā)病灶轉移或發(fā)現(xiàn)新的病灶等）導致患者死亡的時間，總生存期指從入組開始至因任何原因（排除非腫瘤因素）導致患者死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗比較生存率；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC mRNA相對表達量的比較

宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量為（3.64±0.68），明顯高于癌旁正常組織的（1.18±0.23），差異有統(tǒng)計學意義（t=34.948，P=0.000）。

2.2 宮頸癌組織和癌旁正常組織中TNC蛋白表達情況的比較

所有組織均獲得一致結果，無剔除。宮頸癌組織中TNС蛋白陽性表達率為78.85%（82/104），明顯高于癌旁正常組織的32.69%（34/104），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=44.906，P＜0.01）。（表1）

2.3 不同臨床特征的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA及TNC蛋白表達情況的比較

臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量均明顯高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（t=4.778、6.391、5.464，P＜0.01）；臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNС陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.055、5.007、6.162，P＜0.05）；不同年齡、病理類型及肌層浸潤情況的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量及TNС陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 不同臨床特征的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNCmRNA及TNС蛋白表達情況（n=104）

2.4 生存情況分析

經3年隨訪，TNС陽性表達宮頸癌患者的生存率為35.37%（29/82），無病生存率為31.71%（26/82），均低于TNС陰性表達患者的68.18%（15/22）和59.09%（13/22），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.653、5.550，P＜0.05）。（圖1、圖2）

3 討論

圖1 TNС陽性表達（n=82）與陰性表達（n=22）宮頸癌患者的無病生存曲線

圖2 TNС陽性表達（n=82）與陰性表達（n=22）宮頸癌患者的生存曲線

腫瘤微環(huán)境是指包括腫瘤細胞及附近基質細胞在內的一組異質性細胞群體，在腫瘤的增殖、侵襲及轉移中有重要作用，尤以后者作用突出，其通過相關產物介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。TNС是腫瘤微環(huán)境中重要的細胞外基質相關蛋白，已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[10-11]。有研究顯示，TNC基因在正常人群中表達較少，但在胎兒、組織感染、創(chuàng)傷及腫瘤中呈高表達[12]。Jachetti等[13]在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)TNC基因可抑制機體免疫系統(tǒng)，幫助腫瘤細胞逃逸。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織，提示TNС在宮頸癌中呈高表達。后經探討其編碼mRNA和蛋白與宮頸癌臨床特征的關系中發(fā)現(xiàn)，臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期、低分化、有淋巴脈管間隙浸潤的宮頸癌患者的宮頸癌組織中TNC mRNA相對表達量及TNС陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ期、中高分化、無淋巴脈管間隙浸潤的患者，這與其他研究者[14-15]在TNC基因與子宮內膜癌關系的研究結果基本一致，提示臨床工作者可通過檢測腫瘤組織中TNС表達情況輔助完成患者臨床特征的判斷。此外，本研究通過采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，TNС陽性表達患者生存率和無病生存率均明顯低于TNС陰性表達患者，提示其有望成為宮頸癌靶向治療及預測預后的一個重要指標。

綜上所述，TNС在宮頸癌中高表達，與臨床分期、分化程度及淋巴脈管間隙浸潤情況有關，有望成為預測其預后的有效指標。