王新鋒，郭宏強，任瑩坤，徐海元

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）1內(nèi)科綜合病區(qū)，2普外科，鄭州450008

3鄭州金域臨床檢驗中心病理室，鄭州450000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，СRС）是臨床常見的惡性腫瘤，流行病學(xué)研究顯示，中國1988—2009年間СRС的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢[1]。研究顯示，結(jié)直腸從正常黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥趷盒阅[瘤，會經(jīng)歷息肉、腺瘤、上皮內(nèi)瘤變和早癌等多個病理過程，可達(dá)15～20年，如能及早發(fā)現(xiàn)癌變，可降低СRС的發(fā)病率和病死率[2]。因此，近年來與СRС發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物成為了СRС領(lǐng)域的研究重點。DOС-2/DAB2相互作用蛋白（DOС-2/DAB2 interactive protein，DAB2IP）是Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白家族成員之一，可參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、血管生成、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[3]。轉(zhuǎn)錄因子E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）是調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）最重要的轉(zhuǎn)錄因子，有文獻(xiàn)顯示ZEB1在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。本研究探討了СRС組織中DAB2IP和ZEB1的表達(dá)水平及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2019年6月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）收治的СRС患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理檢查確診為СRС；②初次手術(shù)；③具有病灶組織蠟塊標(biāo)本；④年齡＞18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前進(jìn)行過放療、化療；②臨床資料不完整。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入124例患者。其中，男75例，女49例；年齡為33～82歲，≥55歲74例，＜55歲50例；腫瘤部位：左半結(jié)腸38例，右半結(jié)腸35例，直腸51例；分化程度：低分化38例，中分化54例，高分化32例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移77例。取124例患者的СRС組織標(biāo)本及其中40例患者的癌旁正常組織標(biāo)本。

1.2 主要試劑

兔抗人Anti-DAB2IP抗體、兔抗人ZEB1抗體均購自美國Abcam公司，兔抗羊二抗、乙二胺四乙酸（ethylenedia minetetraacetic acid，EDTA）抗原修復(fù)液均購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

組織蠟塊連續(xù)切片，厚度為4 μm，置60℃烤箱中2 h，二甲苯脫蠟、無水乙醇脫苯，90%、80%、70%梯度乙醇水化，3%過氧化氫室溫孵育20 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；將已脫蠟、水化的切片放入EDTA修復(fù)液中，并置于高壓鍋中加熱至沸騰，恒定功率保持20 min，室溫下冷卻，取出切片浸入水槽，輕輕振蕩3～5 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次；甩干切片上殘余PBS，每張切片滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗工作液（PBS稀釋的DAB2IP/ZEB1），對照組以等量PBS替代一抗，濕盒內(nèi)孵育90 min，PBS沖洗2次；甩干玻片表面殘余PBS，滴加二抗，室溫下孵育30 min后采用PBS沖洗2次；甩干玻片，滴加辣根過氧化物酶，室溫下孵育10～20 min，PBS沖洗2次；甩干后在切片上滴加即配顯色劑，室溫下顯色1～2 min，顯微鏡下觀察顯色效果；將顯色后的切片沖洗后使用蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，自來水沖洗，返藍(lán)后梯度乙醇脫水，中性樹膠封片后進(jìn)行觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

DAB2IP蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色及深棕色顆粒為陽性。根據(jù)染色強度評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)染色比例評分：＜1/3為1分，1/3～2/3為2分，＞2/3為3分。染色強度評分與染色比例評分相乘為總分，總分0分為陰性（-），≥1分為陽性，其中1～2分記為+，3～4分記為++，6～9分記為+++[5]。ZEB1蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀、團塊狀或均質(zhì)染色為陽性。根據(jù)染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分；根據(jù)染色比例進(jìn)行評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度評分與染色比例評分相加為總分，總分0分為陰性（-），≥1分為陽性，其中1～2分記為+，3～4分記為++，5～6分記為+++[6]。

1.5 觀察指標(biāo)

比較СRС組織和癌旁正常組織中DAB2IP、ZEB1的表達(dá)水平，分析СRС組織中DAB2IP與ZEB1表達(dá)的相關(guān)性，分析СRС組織中DAB2IP和ZEB1表達(dá)情況與СRС患者臨床特征的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和癌旁正常組織中DAB 2IP和ZEB 1陽性表達(dá)率的比較

СRС組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率低于癌旁正常組織，ZEB1的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表 1 СRС組織和癌旁正常組織中DAB 2IP及ZEB 1陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 CRC組織中DAB 2IP與ZEB 1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，СRС組織中DAB2IP與ZEB1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.737，P＜0.01）。（表 2）

表 2 СRС組織中DAB 2IP與ZEB 1的表達(dá)情況

2.3 不同臨床特征CRC患者CRC組織中DAB 2IP和ZEB 1陽性表達(dá)率的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位的СRС患者СRС組織中DAB2IP和ZEB1的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的СRС患者СRС組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率均低于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=38.871、7.650，P＜0.05）；低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的СRС患者СRС組織中ZEB1的陽性表達(dá)率均高于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=45.191、45.748，P＜0.05）。（表3）

表 3 不同臨床特征СRС患者СRС組織中DAB 2IP和ZEB 1的陽性表達(dá)情況（n=124）

3 討論

局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是СRС患者預(yù)后差的主要原因，EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的一大特征，與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[7]。因此，在EMT中發(fā)揮作用的相關(guān)蛋白受關(guān)注較多。有研究顯示，敲低СRС患者的DAB2IP表達(dá)時，EMT標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)增加，上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白和α-連環(huán)蛋白表達(dá)降低，說明DAB2IP會影響СRС患者的EMT[8]。而另一項研究顯示，敲低乳腺癌患者的ZEB1表達(dá)可明顯抑制波形蛋白的表達(dá)，并明顯增加E-鈣黏蛋白的表達(dá)，表明ZEB1 shRNA可調(diào)控EMT[9]。

本研究結(jié)果顯示，СRС組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率為80.65%，低于癌旁正常組織的97.50%，與劉芳等[10]的研究結(jié)果相近。說明在СRС組織中，DAB2IP表達(dá)降低、缺失。部分研究發(fā)現(xiàn)，DAB2IP在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出表達(dá)下降[11-12]。DAB2IP是一種新的Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白，可作為效應(yīng)蛋白與DAB2的氨基末端相互作用，從而激活DAB2的表達(dá)，抑制多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究結(jié)果還顯示，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的СRС患者СRС組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率更低，說明DAB2IP表達(dá)降低與СRС惡性程度更高、腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險更高有關(guān)。分析原因：①Ras-GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein,GAP）可通過增強內(nèi)源性的Ras-GTP酶活性，將鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）轉(zhuǎn)化為鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）而導(dǎo)致Ras失活，約30%的人類腫瘤表達(dá)癌基因Ras，原因在于Ras對Ras-GAP不敏感而持續(xù)處于活化狀態(tài)[14]；②DAB2IP影響СRС患者的EMT，進(jìn)而抑制СRС細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。另有研究表明，下調(diào)DAB2IP表達(dá)水平可使多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]和胱天蛋白酶3（caspase 3）的表達(dá)明顯減少，使B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）和MСL1的表達(dá)明顯增加，因此DAB2IP還與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[15]。故СRС組織中DAB2IP的陽性表達(dá)率下降，且與СRС的分化程度和轉(zhuǎn)移風(fēng)險有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，СRС組織中ZEB1的陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，且低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表現(xiàn)出更高的ZEB1陽性表達(dá)率。ZEB1可通過與E-鈣黏蛋白上保守的E盒結(jié)合使其轉(zhuǎn)錄下調(diào)，導(dǎo)致EMT，誘導(dǎo)腫瘤侵襲[16]。ZEB1還可通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等信號通路參與對EMT的調(diào)控[17]。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，СRС組織中DAB2IP與ZEB1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。DAB2IP與ZEB1存在相關(guān)性的具體機制尚不明確，但有研究顯示，在DAB2IP敲除的小鼠的前列腺基底細(xì)胞群中發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達(dá)升高[18]。同時，DAB2IP和ZEB1均參與惡性腫瘤的EMT，因此推測DAB2IP和ZEB1在參與EMT的過程中存在某種聯(lián)系。另外，DAB2IP能通過磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，而ZEB1是PI3K-AKT信號通路的下游靶標(biāo)，這也可能是兩者存在相關(guān)性的機制。

綜上所述，СRС組織中DAB2IP表達(dá)水平降低，ZEB1表達(dá)水平升高，且СRС組織中DAB2IP和ZEB1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，兩者均與СRС的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)。