高瓊，馮紅超，唐正龍，馬洪，段曉峰，毛本源#

1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽550004

2貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽5500060

涎腺惡性腫瘤多為涎腺上皮組織來源的惡性腫瘤，可發(fā)生于大涎腺如腮腺、頜下腺和舌下腺，也可發(fā)生于小涎腺如腭腺等，具有組織分型多、細(xì)胞成分復(fù)雜等特點(diǎn)[1]。血液供應(yīng)是包括涎腺惡性腫瘤在內(nèi)的各種實(shí)體瘤生長的必要條件，腫瘤內(nèi)血管系統(tǒng)的建立可以通過多種方式進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤內(nèi)新血管的生成。Maniotis等[2]于1999年在研究人眼侵襲性葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)一種與經(jīng)典的血管生成途徑不同的血管生成模式——血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）。腫瘤細(xì)胞可以通過VM管道結(jié)構(gòu)獲得宿主的血液供應(yīng)，從而為腫瘤組織的進(jìn)行性生長、浸潤和轉(zhuǎn)移提供足夠的血液供應(yīng)[3-4]。VM是指由高度惡性腫瘤細(xì)胞形成的無內(nèi)皮細(xì)胞參與的、由細(xì)胞外基質(zhì)界限的具有輸送血液功能的管腔結(jié)構(gòu)，因此，存在VM結(jié)構(gòu)的惡性腫瘤常具有高度惡性、高轉(zhuǎn)移性、高侵襲性的特點(diǎn)[5]。在臨床上，涎腺惡性腫瘤的發(fā)病率雖然較低，但是其惡性程度及轉(zhuǎn)移率均高，易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[6]。隨著治療手段的不斷深入更新，目前手術(shù)切除是治療涎腺惡性腫瘤的最常用手段，但是盡管行根治性手術(shù)切除，涎腺惡性腫瘤患者的5年生存率仍僅約為40%，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康[7]。因此，研究涎腺惡性腫瘤中有無VM形成，有利于明確腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，對于涎腺惡性腫瘤的治療有重大意義?；诖?，本研究通過對人涎腺惡性腫瘤石蠟標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查及免疫組化結(jié)合的雙重染色，初步研究涎腺惡性腫瘤中是否存在VW結(jié)構(gòu)，觀察不同類型涎腺惡性腫瘤與VM結(jié)構(gòu)的形成有無聯(lián)系，探討腺樣囊性癌的生物學(xué)特征與VM的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2003—2011年貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院保存的經(jīng)手術(shù)切除、福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋的，并經(jīng)過病理證實(shí)的涎腺惡性腫瘤患者的涎腺惡性腫瘤組織標(biāo)本43例；同時(shí)，選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院同期保存的因外傷而行常規(guī)手術(shù)切除患者的正常涎腺組織標(biāo)本5例為對照。43例涎腺惡性腫瘤患者中，男23例，女20例；5例外傷患者中，男2例，女3例。

1.2 主要試劑與儀器

Mouse anti-СD31鼠抗人СD31單克隆抗體、濃縮型DAB顯色試劑盒、PV-9000二步法免疫組化檢測系統(tǒng)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 檢測方法

將獲取的所有組織標(biāo)本蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約為4 μm，將石蠟切片放置于防脫載玻片后，再放置于60℃的烤箱中固定6小時(shí)，裝盒備用。分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色復(fù)查診斷、組織分型及СD31+PAS雙重染色。先將涎腺惡性腫瘤切片按照常規(guī)進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察結(jié)果，復(fù)查病理診斷。將組織切片用二甲苯各浸泡10 min；之后采用梯度乙醇進(jìn)行水化。最后用PBS沖洗以去除切片上殘留的乙醇，每次大約5 min。取適量檸檬酸緩沖溶液（pH=6.0）于熱修復(fù)專用切片盒中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，將切片置于緩沖液中，繼續(xù)加熱至噴漆后3 min。室溫下冷卻，蒸餾水洗。后滴加3%的H2O2，烤箱中37℃孵育20 min。之后采用PBS反復(fù)沖洗。每張標(biāo)本切片滴加1滴一抗（anti-СD31），置于4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗，次日取出標(biāo)本切片，恢復(fù)至室溫，反復(fù)沖洗。每張標(biāo)本切片滴加1滴試劑A（聚合物增強(qiáng)劑），孵育20 min，之后用PBS沖洗。擦干后每張標(biāo)本切片滴加試劑B[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/小鼠免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）聚合物]，37℃孵育30 min，之后用PBS液沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色7 min，待血管內(nèi)皮細(xì)胞著色后，自來水沖洗4 min，終止顯色反應(yīng)。將標(biāo)本切片置于0.5%的過碘酸溶液中還原后再置于Schiff液中，反應(yīng)約15 min。取出標(biāo)本切片，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，每次1 min，之后再流水沖洗3～5 min。蘇木精襯染細(xì)胞核1 min，自來水沖洗2 min。鹽酸酒精分化，自來水返藍(lán)。常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。進(jìn)行觀察。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

VM判斷標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，СD31是重要的內(nèi)皮標(biāo)志物，СD31陽性結(jié)果為主要位于細(xì)胞膜上呈棕黃色顆粒著色。本實(shí)驗(yàn)為區(qū)別內(nèi)皮依賴性血管，選擇СD31作為鑒別分子。同時(shí)腫瘤細(xì)胞基底膜經(jīng)PAS染色后相應(yīng)部位呈淡粉色或櫻桃紅著色。參考Maniotis等[2]方法，在光鏡下觀察，病理切片中觀察到СD31標(biāo)記的內(nèi)皮性血管，其PAS染色也為陽性。以及СD31染色為陰性，由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成管壁的管腔樣結(jié)構(gòu)。

微血管密度（microvessel density，MVD）：參考Weidner校正方法[8]，先在光學(xué)顯微鏡低倍鏡下尋找血管密集的熱點(diǎn)（hot spot）區(qū)域，然后計(jì)數(shù)3～5個(gè)高倍視野內(nèi)的微血管，取其平均數(shù)即為該腫瘤的MVD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 涎腺惡性腫瘤CD31和PAS雙重染色結(jié)果分析

PAS染色結(jié)果顯示，漿液腺泡，呈紅色（圖1A）；黏液腺泡，為無色；漿黏液腺泡，呈淺紅色（圖1B）。43例涎腺惡性腫瘤組織的СD31和PAS雙重染色結(jié)果顯示，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，典型的管道樣擬態(tài)結(jié)構(gòu)由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，管壁無內(nèi)皮細(xì)胞，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞存在，很少見壞死的腫瘤細(xì)胞及炎細(xì)胞。說明VM是由腫瘤細(xì)胞擬血管生成的一種具有血管功能的血管通路。因此VM結(jié)構(gòu)在顯微鏡下表現(xiàn)為由腫瘤細(xì)胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)有紅細(xì)胞。構(gòu)成管腔的腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞之間均無СD31染色陽性物質(zhì)存在，表明無內(nèi)皮細(xì)胞參與此管道的構(gòu)建。在紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間有PAS陽性物質(zhì)間隔，也有部分管腔中有PAS染色陽性物質(zhì)填充。在涎腺惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了PAS陽性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)成條索狀，內(nèi)無管腔，可見部分條索結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮依賴性血管相接，而內(nèi)皮性血管在顯微鏡下可見СD31染色陽性的內(nèi)皮圍成管腔樣或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有時(shí)內(nèi)皮可見PAS染色陽性的基質(zhì)（圖2）。5例正常腺體組織的СD31和PAS雙重染色結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)VM結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 СD31和PAS在正?？谇幌袤w組織中的表達(dá)情況（PV法，×400）

2.2 涎腺惡性腫瘤組織和正常口腔腺體組織中VM情況

43例涎腺惡性腫瘤中，腺樣囊性癌33例，黏液表皮樣癌4例，多形性腺瘤3例，腺泡細(xì)胞癌2例，肌上皮癌1例。СD31和PAS雙重染色結(jié)果顯示，43例涎腺惡性腫瘤的VM陽性率為18.6%（8/43），其中5例腺樣囊性癌VM陽性，1例黏液表皮樣癌VM陽性，1例多形性腺瘤VM陽性，1例肌上皮癌VM陽性。5例正常腺體組織的VM陽性率為0%（0/5）。兩種組織標(biāo)本的VM陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 涎腺惡性腫瘤中血管生成與擬血管生成的相關(guān)性分析

多變量相關(guān)分析結(jié)果顯示，涎腺惡性腫瘤組織中VM的數(shù)量與血管數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.548，P＜0.01）。

2.4 腺樣囊性癌中VM與病理分型的關(guān)系

33例腺樣囊性癌中，實(shí)質(zhì)型12例，腺樣-管狀型21例（管狀型10例，腺樣型11例）；其中腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織中VM陽性率為4.8%（1/21），實(shí)質(zhì)型腺樣囊性癌組織中VM陽性率為33.3%（4/12），實(shí)質(zhì)型腺樣囊性癌組織中VM陽性率高于腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 腺樣囊性癌中VM與MVD的關(guān)系

33例腺樣囊性癌標(biāo)本中，5例VM陽性，28例VM陰性；VM陽性腺樣囊性癌中MVD為（35.09±14.40），高于VM陰性腺樣囊性癌的（24.63±20.63），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.081，P＞0.05）。

3 討論

血管生成擬態(tài)是指由具有可塑性、侵襲性的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的，而無內(nèi)皮細(xì)胞參與條件下細(xì)胞外基質(zhì)界限的管腔結(jié)構(gòu)。腫瘤生長相關(guān)理論提出腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移依賴于新血管的形成，從而使腫瘤獲得豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和氧，減少其中心壞死的出現(xiàn)，更利于腫瘤的生長。由于VM無內(nèi)皮細(xì)胞襯里，存在一層PAS陽性基底膜結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞可與血液直接接觸，因此腫瘤細(xì)胞可獲得更豐富的營養(yǎng)和氧[9]。由于VM結(jié)構(gòu)缺少內(nèi)皮屏障，構(gòu)成VM管壁結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞脫落后可直接進(jìn)入血流，為腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了有利條件。大量研究表明，VM僅存在于一些高侵襲性的惡性腫瘤中，如腎透明細(xì)胞癌、乳腺導(dǎo)管癌等[10-11]。因此VM存在與否與腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究通過СD31+PAS雙重染色對涎腺惡性腫瘤組織進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)涎腺惡性腫瘤組織中存在VM結(jié)構(gòu)，而正常腺體組織中無VM結(jié)構(gòu)。光鏡下對VM結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)VM結(jié)構(gòu)是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的非內(nèi)皮細(xì)胞襯附的管道或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在VM管腔中，PAS陽性物質(zhì)將腫瘤細(xì)胞與管腔中的血流分隔開，部分標(biāo)本中可見PAS陽性物質(zhì)填充部分管腔；本研究還發(fā)現(xiàn)，在涎腺惡性腫瘤中存在PAS陽性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈條索狀，內(nèi)無管腔，可見部分條索結(jié)構(gòu)可與內(nèi)皮依賴性血管相接。本研究結(jié)果與Maniotis等[2]研究發(fā)現(xiàn)的典型的擬血管結(jié)構(gòu)是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成，管壁無內(nèi)皮細(xì)胞，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞存在相符合。構(gòu)成管腔的腫瘤細(xì)胞間及腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞間均無СD31染色陽性物質(zhì)存在，表明無內(nèi)皮細(xì)胞參與此管道的構(gòu)建。在紅細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間有PAS陽性物質(zhì)間隔，也有部分管腔中有PAS染色陽性物質(zhì)填充。VM是由腫瘤細(xì)胞擬血管生成的一種具有血管功能的血管通路。本研究結(jié)果顯示，43例涎腺惡性腫瘤組織中，有部分VM結(jié)構(gòu)可與內(nèi)皮性血管相連，腫瘤組織通過VM與宿主血管相連通，從而為腫瘤組織的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移提供足夠的血液供應(yīng)；涎腺惡性腫瘤組織與正常腺體組織中VM的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；本研究還對涎腺惡性腫瘤血管與VM數(shù)量之間關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示涎腺惡性腫瘤組織中VM的數(shù)量與血管數(shù)量呈正相關(guān)（P＜0.01）。

腺樣囊性癌是涎腺惡性腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，是一種侵襲性很強(qiáng)的腫瘤，通過黏膜下及纖維組織向腫瘤周圍播散，同時(shí)有沿神經(jīng)擴(kuò)散[12-13]。涎腺腺樣囊性癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，常見的轉(zhuǎn)移部位為肺[14-15]。本研究根據(jù)病理類型不同，對33例涎腺腺樣囊性癌組織中VM的陽性情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示實(shí)質(zhì)型腺樣囊性癌組織中VM陽性率高于腺樣-管狀型腺樣囊性癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示涎腺惡性腫瘤的惡性程度越高或侵襲行為越強(qiáng)的病理分型VM陽性率越高，侵襲行為越強(qiáng)或惡性程度越高的惡性腫瘤細(xì)胞本身基因表型越復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞的可塑性越強(qiáng)，同時(shí)腫瘤生長速度越快，均可導(dǎo)致腫瘤局部缺氧壓力越高，越促進(jìn)VM的形成。

Folberg等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PAS染色陽性物質(zhì)圖案狀分布的特點(diǎn)與葡萄膜黑色素瘤的預(yù)后密切相關(guān)。Fan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性膽囊癌的預(yù)后更差，VM生成是原發(fā)性膽囊癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素之一。目前組織活檢病理學(xué)檢查等技術(shù)可以用于發(fā)現(xiàn)有無VM形成[18]。若術(shù)前能夠充分了解腫瘤供血系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，便可以對腫瘤的具體情況做出更準(zhǔn)確地評估，從而選擇更為適合的治療方式，對于手術(shù)范圍的確定可更為合理。減少了手術(shù)中由于手術(shù)范圍過小腫瘤術(shù)后短期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或手術(shù)范圍過大影響患者術(shù)后的生存質(zhì)量。VM具有一定的可塑性，在光鏡下形成VM管壁的腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮性血管的內(nèi)皮細(xì)胞相似，采用一般的組織病理學(xué)方法難以將兩者區(qū)分開，為了更有效地提高VM的檢出率，采用СD31+PAS雙重染色來檢測VM，并證明該方法是可行的、經(jīng)濟(jì)的。VM的檢測對于判斷涎腺惡性腫瘤的預(yù)后具有一定的意義。然而腫瘤的血液供應(yīng)途徑相當(dāng)復(fù)雜，因此臨床上如果能結(jié)合不同血管的表達(dá)情況對涎腺惡性腫瘤的預(yù)后進(jìn)行評估則會(huì)更為準(zhǔn)確。如何更有效的、定量并綜合分析VM與涎腺惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后之間的相關(guān)性，還需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，涎腺惡性腫瘤中VM的存在對患者的預(yù)后提出了巨大的挑戰(zhàn)，為抗血管治療提供了新的靶點(diǎn)。