王少倫，楊宏

（北京工業(yè)大學水質(zhì)科學與水環(huán)境恢復工程北京市重點實驗室，北京100124）

引 言

氨氮廢水的排放易于引發(fā)水體富營養(yǎng)化問題[1]。污水廠大多使用活性污泥法處理污水，活性污泥特異性差，無法更好地發(fā)揮出單一類菌群的處理能力，制約了污水處理能力的提升。另一方面，硝化細菌增殖速率緩慢，容易流失，對外界環(huán)境條件的變化敏感，對于寒冷地區(qū)相對較低的水溫或工業(yè)廢水相對復雜的水質(zhì)，氨氮硝化過程不理想仍然是生物脫氮過程的制約因素[2]。

相較于傳統(tǒng)的活性污泥法，包埋固定化技術成為了現(xiàn)今水處理行業(yè)的熱門研究對象[3]。同時，利用包埋固定化技術來實現(xiàn)低溫條件下的高效硝化是目前生物脫氮技術的研究熱點[4-5]。該技術能發(fā)揮出單一菌種的處理能力，特異性強，同時能維持較高的微生物濃度，增強微生物的高效性和耐受性[6-7]，在水處理領域展現(xiàn)出巨大的應用前景。Li等[8]采用固定化硝化細菌處理氨氮廢水的實驗中，硝化速率達到39 mg·(L·h)-1。蘇姍等[9]采用硝化生物活性填料對市政污水進行處理，在填充率為12%，DO 濃度為4～5 mg·L-1條件下，填料的最大氨氧化速率為30.20 mg·(L·h)-1。Inoue 等[10]以聚乙烯醇為載體固定硝化細菌，填充率為50%時處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1。前人對填料的制備研究往往局限于實驗室小規(guī)模，對實際污水研究少，更難以涉及解決低溫條件下硝化困難、出水難以達標等問題；其次，填料活性低、處理效果差，影響了其工業(yè)化應用。

基于上述的背景分析，本研究采用課題組研發(fā)的包埋硝化活性填料，經(jīng)活性恢復實驗后，重點考察了高效包埋填料對HRT、溫度的適應性變化以及低溫、常溫條件下填料處理市政污水的實驗，并摸索了包埋細菌的生長規(guī)律，考察了填料的內(nèi)部結構，旨在為實際應用提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗用水和污泥來源

實驗采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有：NH4Cl、KH2PO4（根據(jù)NH4+-N 濃度調(diào)整，N∶P 為5∶1），MgSO4·7H2O(3 mg·L-1)，CaCl2(2 mg·L-1)。每升進水中加入1 ml 微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.50 g·L-1)，Na2MoO4·2H2O(0.12 mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.20 mg·L-1)，MnCl2·4H2O(0.50 mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.70 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.60 mg·L-1) 和FeCl3·6 H2O(0.80 mg·L-1)。污泥取自實驗室穩(wěn)定、高效的硝化反應器，MLSS 為8000 mg·L-1，比氨氧化速率可達0.84 g·(g·d)-1。

1.2 包埋硝化活性填料的制備與實驗裝置

取上述污泥80 L，離心濃縮后（4%質(zhì)量干重）與質(zhì)量分數(shù)15% PVA 凝膠混合，加入添加劑碳酸鈣38.30 g·L-1，活性炭10 g·L-1[11-16]，均勻地涂在網(wǎng)筒狀結構載體上，放入過飽和的硼酸溶液進行交聯(lián)，用清水清洗后將載體切成長度1 cm、壁厚2 mm 的筒狀填料，填充于聚乙烯制成的懸浮球（直徑100 mm）中。實驗采用有機玻璃反應器以連續(xù)流方式運行，通過PCL 在線控制pH、DO、溫度等實驗參數(shù)，反應器有效容積為180 L，包埋填料填充率為10%。

1.3 包埋填料活性恢復

將1.2 節(jié)新制作的包埋填料在適宜條件下通過不斷改變進水氨氮負荷的方式，進行活性恢復實驗，保持溫度為24℃，pH 為7.30～7.50，DO 為3～5 mg·L-1，HRT 為5 h。每天監(jiān)測進出水氨氮濃度，以出水氨氮濃度≤20 mg·L-1作為指示標準，提高進水氨氮濃度，從而保持底物充足，不斷提高氨氮去除效果，待氨氮去除能力達到穩(wěn)定后，即認為包埋填料活性恢復完成。

1.4 包埋填料去除氨氮的影響因素

1.4.1 包埋填料對HRT 的適應性變化 以高效包埋填料為考察對象，考察不同HRT 下硝化細菌活性的適應性變化。DO 為5 mg·L-1，pH 為7.30～7.50，溫度為24℃，HRT 分別為5、3、1 h，通過測定進出水氨氮濃度及氨氧化速率的變化來反應硝化活性。

1.4.2 包埋填料對溫度的適應性變化 以HRT 為1 h條件下穩(wěn)定運行的包埋填料為考察對象，考察降溫過程和升溫過程對填料硝化活性的影響，下降溫度分別為24、20、16、12℃，上升溫度分別為16、20、24℃。

1.4.3 低溫下階段性增加HRT 對包埋填料硝化特性的影響 針對實驗室低溫條件下，出水氨氮不達標現(xiàn)象，考察階段性增加HRT 對硝化活性及出水氨氮濃度的影響。HRT 分別為1、2、3 h，水溫為12℃，DO 為5 mg·L-1，pH 為7.30～7.50，進水氨氮濃度為50 mg·L-1。

1.5 包埋填料處理低溫、常溫市政污水的實際應用

市政污水為典型A2O處理流程的初沉池沉淀出水。該實驗考察高效包埋填料在低溫、常溫條件下處理市政污水的實驗效果。反應器運行參數(shù)：進水氨氮為34.45～45.15 mg·L-1，pH 為7.17～7.42，DO 為5 mg·L-1，溫度分別為12、24℃。

1.6 分析方法

1.6.1 水質(zhì)分析方法 三氮的測定方法均為標準分析法[17]。NH4+-N 采用納氏試劑光度法測定(UV-1600)；NO2--N 采用N-(1-萘基)乙二胺光度法測定(UV-1600)；NO3--N 采用紫外分光光度法測定(UV-1600)；pH 采用在線儀表測定(YD-pH01)；DO采用在線儀表測定(YD-DO01)；溫度采用溫度控制器控制。

1.6.2 掃描電鏡分析 SEM 樣本與處理方法參照Liu 等[18]方法，實驗具體操作如下：取應用實驗結束后的包埋填料，清洗后加入2.5%戊二醇溶液進行固定，置于4℃冰箱中固定超過12 h，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 遍，隨后進行梯度（50%、70%、80%、90%、100%的乙醇）脫水，每次10～15 min，后用乙酸異戊酯置換，徹底脫水后冷凍干燥12 h，后進行噴金處理，采用SU8020 掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.6.3 熒光定量PCR 分析 分別取初始包埋填料、活性恢復結束后及市政污水應用實驗結束后的包埋填料，分別標記為A、B、C，從樣本中提取DNA 并用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，采用特異性引物對(amoA-1F、amoA-2R)對AOB amoA 功能基因進行qPCR擴增[19]。

qPCR 分 析 采 用 amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′ ) 和 amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)引物對[19]，分別對三個樣品的AOB菌基因拷貝數(shù)進行分析。采用SYBRGreen法進行熒光定量擴增，儀器為杭州朗基MG96+型PCR儀。樣品反應體系與標準曲線PCR體系相同，根據(jù)抽提質(zhì)粒計算目的基因拷貝數(shù)，通過預實驗分別選取標準品的10-2～10-7稀釋液用于制備標準曲線，根據(jù)標準曲線計算出未知樣品基因的表達量。

qPCR 具體反應控制過程如下：95℃預變性5 min；95℃變性5 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；在60～95℃之間制備熔解曲線確定基因特異性。完成上述步驟后，把加好樣本的96孔板放在博日9600plus型熒光定量PCR儀中進行反應。

2 結果與討論

2.1 包埋填料活性恢復階段

從圖1中可以看出，隨著氨氮處理負荷的增加，包埋填料氨氧化效率開始快速增長，亞氮積累率升高，微生物的活性開始恢復。第1～9 d（DO 為3～4 mg·L-1）氨氧化速率處于快速增長階段，增長至63.22 mg·(L·h)-1，亞氮積累率達到72.73%；第10～14 d（DO 為4～5 mg·L-1）氨氧化速率呈中速增長階段，增長至89.04 mg·(L·h)-1；第15～18 d（DO 為4～5 mg·L-1）進水氨氮控制在500 mg·L-1左右，氨氧化速率依然緩慢增加，最終增長至93.20 mg·(L·h)-1，亞氮積累率穩(wěn)定在76%左右，包埋填料實現(xiàn)了快速恢復。該實驗恢復周期短，硝化速率得到了大幅度提升，明顯優(yōu)于郝婧[20]的包埋顆粒氨氧化速率最高為30 mg·(L·h)-1的實驗研究。

圖1 包埋填料活性恢復過程Fig.1 Active recovery process of embedded filler

初始包埋填料效率增長緩慢，后期快速增長，原因可能是前期的包埋處理對硝化細菌的活性產(chǎn)生了負面影響，而后期細菌活性得到恢復以及硝化細菌在填料內(nèi)部不斷增殖。隨著微生物量持續(xù)增加，填料對氨氮的去除能力也不斷增強，這一點與2.5 節(jié)qPCR 結果是一致的。在恢復前期，亞氮積累率升高，這是因為包埋菌源中NOB 占有比例少，而后期出現(xiàn)了小幅度的下降，這可能與DO 的提高有關系。在低溶解氧環(huán)境下AOB 相對于NOB 對溶解氧具有更強的親和力，氧利用能力也較強，NOB 的生長會受到抑制[21-23]。

2.2 包埋填料去除氨氮的影響因素

2.2.1 包埋填料對HRT 的適應性變化分析 水力停留時間(HRT)在一定程度上影響著系統(tǒng)處理效果，還直接決定了生物反應器容積的大小。傳統(tǒng)的污水生物處理系統(tǒng)HRT 一般較長，保證出水水質(zhì)，但處理設施占地較大，影響到處理工程的基建投資[24]。針對高效包埋硝化活性填料，本實驗考察了填料在HRT 變化時對氨氮的去除效果，為今后處理市政污水、高氨氮工業(yè)廢水提供參考。

由圖2 所示，第7 d 和17 d 時HRT 分別調(diào)整為3 h 和1 h，進 水 氨 氮 濃 度 分 別 為290.12 mg·L-1和102.36 mg·L-1。在改變條件后，出水氨氮濃度有所升高，氨氧化速率呈現(xiàn)不同程度的下降，隨后逐漸升高，并于第16 d 和26 d 分別達到85.67 mg·(L·h)-1和80.62 mg·(L·h)-1。氨氧化速率出現(xiàn)下降的原因可能是進水負荷調(diào)整時，包埋填料受到?jīng)_擊，硝化活性受到不同程度的影響。同時，由于基質(zhì)和填料內(nèi)外溶解氧濃度梯度，使得硝化細菌易于分布在表層及淺表層[25]，部分細菌受沖擊流失，出水也檢測到了污泥的流失，從而導致氨氧化速率發(fā)生波動?？傮w來看，包埋填料能夠快速適應水力條件的變化，HRT對包埋填料硝化特性影響較小。董亞梅等[26]采用包埋顆粒進行的不同梯度的HRT 實驗同樣得出了HRT的改變對包埋顆粒硝化特性影響較小的結論。

為模擬處理市政污水，于27 d 將進水氨氮濃度下調(diào)為50 mg·L-1，HRT仍為1 h，從圖2可以看出，出水氨氮濃度穩(wěn)定在1 mg·L-1以下，表明填料氨氮處理效果優(yōu)良。

2.2.2 包埋填料對溫度的適應性變化分析 溫度不僅影響硝化菌的比增長速率，而且影響硝化細菌的活性[27]。本實驗模擬了降溫、升溫兩個過程，考察了填料活性的變化規(guī)律，結果如圖3所示。

圖2 HRT對硝化活性的影響Fig.2 Effect of HRT on nitrification activity

由圖3 可知，進水氨氮濃度都控制在50 mg·L-1左右。圖3(a)為降溫過程，隨著溫度的降低，氨氧化速率不斷下降，出水氨氮濃度不斷升高。當水溫為24℃時，出水氨氮濃度最終穩(wěn)定在1 mg·L-1以下；水溫下降為20、16 和12℃時，出水氨氮濃度分別上升為5、10 和20 mg·L-1左右。圖3(b)為升溫過程，隨著溫度的增加，氨氧化速率逐漸升高，出水氨氮濃度不斷下降。當水溫上升至16、20 和24℃時，出水氨氮濃度最終分別下降為6.23、2.87 和0 mg·L-1，優(yōu)于圖3(a)中降溫過程的氨氮去除效果，表現(xiàn)出了更強的氨氮去除能力。

由圖3 降溫、升溫變化過程可見，當調(diào)整溫度時，氨氧化速率都存在明顯的變化，而后趨于穩(wěn)定。該現(xiàn)象說明包埋處理后的硝化細菌對溫度變化仍然敏感，同時它具有較強的適應能力，短時間內(nèi)能適應溫度的變化，這與尚海源等[28]、Guo 等[29]實驗結果是一致的，從而證明其可以應對季節(jié)性溫差變化，保障出水穩(wěn)定，具有相當優(yōu)越的工程應用價值。

圖3 溫度對硝化活性的影響Fig.3 Effect of temperature on nitrification activity

2.2.3 低溫下階段性增加HRT 對包埋填料硝化特性的影響 由2.2.2 節(jié)實驗可知，當水溫為12℃時，最終出水氨氮濃度達到19.25 mg·L-1，為了提高氨氮去除效果，降低出水氨氮濃度，通過調(diào)整HRT，尋找該運行條件下的最佳水力停留時間，結果如圖4所示。

由圖4可知，當增大HRT時，氨氮去除率會迅速升高。當水溫為12℃、HRT 為1 h 時，氨氮去除率僅達到60%左右。在第5 d 時，將HRT 增大至2 h，氨氮去除率迅速升高，并穩(wěn)定在90%以上，此時出水氨氮在5 mg·L-1以下。在第11 d 時，將HRT 增大至3 h，出水氨氮迅速下降并維持在1 mg·L-1以下，進水氨氮基本完全去除。HRT 的大小影響著污水處理廠的處理水量、效益以及工程的基建投資等多個方面，因而，較短的HRT 是應用包埋固定化技術的巨大優(yōu)勢之一。

圖4 低溫條件下HRT對硝化活性的影響Fig.4 Effect of HRT on nitrification activity at low temperature

2.3 填料處理市政污水過程中去除氨氮效果分析

在考察了包埋填料對溫度、HRT 適應性變化的基礎上，針對低溫、常溫條件下的市政污水，進行包埋填料處理市政污水的應用實驗。進出水氨氮濃度和氨氮去除率變化情況如圖5所示。

由圖5可知，進水氨氮濃度并不穩(wěn)定，平均濃度為39.97 mg·L-1。第一階段(1～10 d)水溫為12℃，HRT 為2 h，氨氮去除率開始僅為71.91%，低于處理人工廢水時的效果，第3 d 后逐漸增大，出水氨氮濃度逐漸降低并穩(wěn)定在5 mg·L-1左右。該現(xiàn)象說明包埋填料前期存在適應復雜水質(zhì)的過程并且適應能力較強。在第二階段(11～19 d)，將HRT 增大至3 h后，氨氮去除率迅速升高，出水氨氮濃度迅速降低并穩(wěn)定在1 mg·L-1以下。當處于第三階段(20～29 d)時，HRT為1 h，水溫為24℃，改變條件后出水氨氮濃度稍有升高后迅速降低，并穩(wěn)定在1 mg·L-1以下，強于污水廠活性污泥的氨氮處理能力，具有廣闊的應用前景。

圖5 包埋填料對市政污水中氨氮的去除效果Fig.5 Removal effect of ammonia nitrogen in municipal sewage with embedded filler

2.4 包埋填料SEM分析

圖6為包埋填料實物及填料切面不同放大倍數(shù)(20000、10000)的SEM 圖。如圖6 所示，包埋填料內(nèi)部有良好的孔隙度，即存在大量的供細菌附著生長的骨架結構以及可用于傳輸氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的通道。因此，包埋填料為微生物提供了良好的生長微環(huán)境。同時內(nèi)部分布大量桿狀菌和球狀菌，充分說明包埋填料已經(jīng)成為了良好的微生物載體。

圖6 包埋填料實物及掃描電鏡圖Fig.6 Embedded filler and SEM images

2.5 qPCR結果分析

對三組包埋填料樣本中的AOB 進行了熒光定量分析，PCR分析結果見表1。

樣本編號拷貝數(shù)×10-8/(copies/g)A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3定量值1.37 1.56 1.11 3.58 3.11 2.95 2.15 2.38 2.12平均值1.34 3.21 2.21

由表1 可以看出，樣本B 中種群豐度遠大于A，表明經(jīng)過恢復階段后，硝化細菌不僅活性得到恢復，在填料內(nèi)部也不斷增殖。隨著微生物量持續(xù)增加，對氨氮的去除能力也不斷增強，從分子生物學層面上表現(xiàn)了高效包埋填料的優(yōu)勢，從而反映了填料內(nèi)部良好的生存環(huán)境。由此可見，活性恢復階段是形成高效包埋填料必不可少的階段。

樣本C 種群豐度低于樣本B，說明市政污水環(huán)境下包埋填料內(nèi)細菌數(shù)量是低于實驗室恢復階段的，可能是因為底物濃度低或者復雜水質(zhì)條件使得細菌數(shù)量維持在相對低水平。該填料的氨氧化速率同樣低于活性恢復后的填料，主要原因可能是由填料內(nèi)部細菌數(shù)量決定的。氨氧化速率與細菌的數(shù)量呈正相關，包埋填料對氨氮的去除效果會隨細菌數(shù)量的增加而增加，邵勇等[30]、鄧巖巖等[31]都通過實驗得出了載體內(nèi)微生物量增加，對氨氮的去除能力也不斷增強這一結論。同時，底物濃度、溫度、水質(zhì)等環(huán)境因素可能是決定細菌內(nèi)部數(shù)量的重要因素。

從細菌增殖衰亡現(xiàn)象可以看出，硝化細菌易在包埋填料中生長繁殖，此外，如果以更低的初始包埋細菌量進行固定化，填料仍能具有較好的氨氮處理效果，這對于降低工程成本具有重要意義，此項實驗研究正在進行中。

3 結 論

（1）采用薄層PVA 制作包埋填料，通過連續(xù)流恢復實驗實現(xiàn)了氨氧化速率93.20 mg·(L·h)-1的高表達。

（2）在常溫條件下，包埋填料硝化速率受HRT影響較小，均穩(wěn)定在80 mg·(L·h)-1以上，同時包埋填料能快速適應降溫、升溫等季節(jié)性溫差變化，保障了出水穩(wěn)定。

（3）在市政污水低溫和常溫條件下，當HRT 分別為3 h 和1 h 時，進水氨氮基本完全去除，表現(xiàn)出了較強的處理能力，表明包埋填料用于市政污水硝化是完全可行的。

（4）SEM 結果顯示包埋填料內(nèi)部有良好的孔隙度，網(wǎng)狀結構明顯；熒光定量PCR 結果顯示硝化細菌大量增殖，說明包埋填料為微生物提供了良好的生長微環(huán)境。