尹春華，彭思雨，馬壘珍，張海洋，閆海

（北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100083）

引 言

酶固定化技術(shù)是采用載體材料將酶固定或限制在一定的空間內(nèi)，保留其催化活性，并可回收及重復(fù)使用的一類技術(shù)，是酶工業(yè)應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)之一。近年來(lái)，納米材料作為新型酶固定化載體，由于具有良好的生物相容性、超大的比表面積和較小的擴(kuò)散限制等特性而受到人們的廣泛關(guān)注[1-3]。納米材料用于固定化具有很多優(yōu)勢(shì)，譬如具有巨大比表面積、酶負(fù)載量高；能夠和酶蛋白分子多點(diǎn)結(jié)合，一定程度減少蛋白質(zhì)去折疊，從而穩(wěn)定酶的活性構(gòu)象，固定化后酶的熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性都有顯著提高[4-7]。

納米材料的傳統(tǒng)制備方法主要包括物理和化學(xué)法，具有能耗高、易造成環(huán)境污染等不足。近年來(lái)，人們愈來(lái)愈重視一種合成納米材料的新型方法——生物法。生物法是指利用微生物或一些高等植物在常溫、常壓下合成無(wú)機(jī)納米粒子，過(guò)程中不需使用有毒化學(xué)物質(zhì)，也不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品，具有生態(tài)友好和成本低等優(yōu)點(diǎn)[8]。早在1989 年，Nature 雜志就報(bào)道了光滑念珠菌(Candida glabrata)合成納米CdSe[9]。但生物法引起人們的廣泛關(guān)注還是在近十幾年，2001年Mukherjee等[10]報(bào)道尖孢鐮刀霉(Fusarium oxysporum)成功合成Ag 納米粒子，并首次提出了納米生物合成技術(shù)的概念，此后，納米材料生物合成的研究報(bào)道大量出現(xiàn)[11-13]，納米ZnO[14]，Au[15]，Ag[16]，F(xiàn)e3O4[17]和CdS[18]等都已被生物法陸續(xù)成功合成。目前納米材料的生物法合成研究主要集中于植物或微生物種類篩選、合成條件優(yōu)化及得到的納米材料的表征分析等，而對(duì)得到的納米材料應(yīng)用研究較少，尤其在酶固定化的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

納米氧化鋅是一種重要的無(wú)機(jī)納米材料，與普通納米材料相比，不僅具有比表面積大、吸附力強(qiáng)等特性，而且具有光化學(xué)活性、能高效吸收衰減雷達(dá)波、屏蔽紫外線和抑菌消毒等優(yōu)良性能[16]，在光化學(xué)領(lǐng)域[19]、食品和動(dòng)物飼料[20]以及酶固定化等生物技術(shù)[21-22]領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。Husain 等[22]采用納米氧化鋅成功固定了米曲霉β-半乳糖苷酶，顯著提高了酶的pH 和熱穩(wěn)定性。相對(duì)于納米金、銀和氧化鈦等其他納米材料，納米氧化鋅用于酶固定化具有成本低、保存方便（納米氧化鋅抑菌性能好）等優(yōu)勢(shì)，得到的固定化酶不僅可用于催化物質(zhì)轉(zhuǎn)化，也可作為生物傳感器的酶電極[21]。本研究篩選得到一種高耐硫酸鋅的植物乳桿菌用于納米氧化鋅的合成，對(duì)得到的納米粒子進(jìn)行了一系列的分析表征，并將其用于固定假絲酵母脂肪酶。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

假絲酵母脂肪酶(Candidasp.lipase)，北京化工大學(xué)贈(zèng)送。傳統(tǒng)法納米氧化鋅(30 nm± 10 nm,99.9%)購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司。硫酸鋅（分析純）購(gòu)于天津福晨化學(xué)試劑公司，普通氧化鋅等其他試劑皆為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司。植物乳桿菌菌株LP1～LP4，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 植物乳桿菌耐ZnSO4性能測(cè)定

往MRS 培養(yǎng)基中加入適量ZnSO4，得到不同ZnSO4濃度(0～80 mmol/L)的MRS 培養(yǎng)基，高壓滅菌后分別轉(zhuǎn)接4 株植物乳桿菌，接種量為1%，37℃下厭氧培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)中每隔2 h取樣，用分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD600，得到各菌的生長(zhǎng)曲線，以各菌在不同ZnSO4濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最高細(xì)胞濃度（用OD600值表示）評(píng)價(jià)其耐ZnSO4能力，每個(gè)ZnSO4濃度均設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.3 植物乳桿菌合成ZnO-NPs

納米氧化鋅的合成在100 ml 的錐形瓶進(jìn)行，將高耐ZnSO4的植物乳桿菌LP4 接種（接種量1%）于20 ml 滅菌MRS 中，100 r/min 搖床37℃厭氧培養(yǎng)24 h（OD600為7.0 左右）。接著向該培養(yǎng)菌液加入等體積的0.9%的無(wú)菌生理鹽水稀釋后再厭氧培養(yǎng)24 h。然后無(wú)菌條件下用0.4 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH為6，并加入ZnSO4溶液至其濃度為40 mmol/L，搖勻后置于恒溫水浴鍋中80℃反應(yīng)10 min 后，37℃下靜置陳化12 h，過(guò)濾得到白色沉淀經(jīng)冷凍干燥即得到粗納米氧化鋅，用于后續(xù)表征測(cè)試。

1.4 酶活測(cè)定方法

酶活測(cè)定采用橄欖油乳化法[23]。脂肪酶酶活的定義：脂肪酶在37℃、pH 8.0 下每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量，即為1個(gè)國(guó)際單位（U）。

1.5 掃描電鏡測(cè)試

將充分干燥后的樣品置于研缽內(nèi)充分研磨，用棉簽蘸取少量研磨后的粉末，輕彈棉簽使粉末均勻分散在固體導(dǎo)電膠表面，用吸耳球輕輕吹去未被黏附的粉末，噴金后由日立SU8010冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行測(cè)試。

1.6 透射電鏡測(cè)試

取2 mg 樣品于50 ml 的無(wú)水乙醇中充分超聲分散，用毛細(xì)吸管吸取樣品滴加在置于圓形濾紙上的銅網(wǎng)上，反復(fù)滴加數(shù)次，將載有銅網(wǎng)的濾紙片置于日光燈下晾干。將晾干后的銅網(wǎng)置于載樣器進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)儀器為JEM-2010高分辨率透射電鏡。

1.7 X射線衍射測(cè)試

將干燥后的樣品在600℃高溫下進(jìn)行煅燒灰化，并保溫3 h，除去納米材料中的少量菌體，然后將灰化后的樣品充分研磨，除去結(jié)塊，進(jìn)行XRD 測(cè)試確定其晶型。測(cè)試角為2θ，測(cè)試范圍10°～80°。

1.8 紫外可見吸收光譜測(cè)試

將干燥后的樣品于去離子水中超聲分散，靜置一段時(shí)間后，取上清液于PerkinElmer 酶標(biāo)儀中進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)ZnO 納米粒子的吸收峰，以去離子水作為參照，掃描波長(zhǎng)范圍200～1000 nm。

1.9 脂肪酶固定化方法

為了排除合成粗產(chǎn)物中菌體對(duì)固定化的影響，對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單純化：將粗產(chǎn)物于水中超聲重懸，過(guò)0.45 μm 濾膜去除菌體，濾液濃縮干燥后得到白色粉末即生物納米ZnO 用于酶固定化。往25 ml 錐形瓶中加入pH 8.0 的磷酸緩沖液10 ml，50 mg 的固定化載體（生物納米ZnO、普通氧化鋅、傳統(tǒng)納米ZnO），超聲30 min 待載體充分分散后加入適量酶液，200 r/min 搖床中恒溫（10℃）吸附固定16 h。然后4℃、10000 r/min 離心10 min 收集固體沉淀，用pH 8 磷酸緩沖液重懸洗滌后再離心收集沉淀經(jīng)冷凍干燥即得固定化酶，分別測(cè)定固定化酶和廢液（離心棄液和洗滌液）的酶活，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。本文中酶活收率定義為固定化酶總酶活與固定化前加入的游離酶總酶活的百分比。酶固載率為固定載體吸附的游離酶酶活與固定化中加入的游離酶總酶活的百分比，前者由游離酶總酶活減去廢液中酶活計(jì)算得到。

1.10 游離酶與固定化酶pH 和熱穩(wěn)定性的測(cè)定與比較

取冷凍干燥后的50 μg 固定化酶加入到不同pH 的5 ml 磷酸緩沖液中充分分散，置于4℃下放置2 h 后離心去上清液，用pH 8 的磷酸緩沖液重懸，測(cè)定殘存酶活百分?jǐn)?shù)用于評(píng)價(jià)固定化酶pH 穩(wěn)定性（初始酶活定義為100%，測(cè)定條件見1.4 節(jié)）。熱穩(wěn)定性測(cè)定方法：稱取質(zhì)量均為50 μg 的固定化酶置于5 ml pH 8的磷酸緩沖液中，分別于不同溫度下恒溫放置2 h 后立即降溫到4℃，然后測(cè)定各自的殘存酶活百分?jǐn)?shù)（初始酶活定義為100%）。然后與按同樣方法測(cè)得的游離酶的穩(wěn)定性進(jìn)行比較。

1.11 固定化酶的操作穩(wěn)定性測(cè)定

往25 ml 敞口錐型瓶中加入7.5 mmol 的癸酸與含水4%的甘油(5 mmol)搖勻，接著加入0.2 g納米固定化酶混勻，40℃恒溫?fù)u床中(轉(zhuǎn)速為200 r/min)反應(yīng)24 h 后取樣測(cè)定癸酸轉(zhuǎn)化率。每一批次反應(yīng)結(jié)束后，往錐型瓶中加入15 ml體積比為1∶1叔戊醇和正己烷混合溶劑稀釋，然后離心回收固定化酶，室溫下風(fēng)干后接著用于下批次反應(yīng)，每批次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，轉(zhuǎn)化率取其平均值。癸酸轉(zhuǎn)化率的測(cè)定采用滴定法：吸取0.1 g 左右反應(yīng)液，加入10 ml體積比為2∶1 的乙醇-乙醚混合液稀釋并終止反應(yīng)，以酚酞為指示劑，用0. 05 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定其中的癸酸。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐Zn2+植物乳桿菌篩選

利用微生物合成無(wú)機(jī)納米粒子，一般需將納米前體（較高濃度的無(wú)機(jī)金屬離子）加入培養(yǎng)基中，通過(guò)微生物的生命活動(dòng)或其代謝產(chǎn)物將其轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的金屬或金屬氧化物納米粒子。因此，微生物耐受相應(yīng)離子或鹽的能力是合成金屬納米粒子的關(guān)鍵因素之一。植物乳桿菌是乳酸菌的一種，是常見的益生菌，大多生長(zhǎng)迅速但耐鹽能力不強(qiáng)。為了得到合成納米氧化鋅能力強(qiáng)的植物乳桿菌菌株，本研究先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的4 株植物乳桿菌耐Zn2+能力進(jìn)行考察：在不同ZnSO4濃度的培養(yǎng)基中接入植物乳桿菌種于37℃厭氧培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌液的OD600用以監(jiān)測(cè)其生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明這四株植物乳桿菌生長(zhǎng)周期在24～36 h，在含不同濃度ZnSO4的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況見表1，可見這四株植物乳桿菌耐Zn2+能力差異非常顯著。菌株LP2 與LP3 耐Zn2+能力較差，只能在ZnSO4濃度低于20 mmol/L 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。LP1 的ZnSO4耐受濃度為40 mmol/L，而LP4 耐受能力最強(qiáng)，在60 mmol/L 的ZnSO4濃度仍然能夠生長(zhǎng)良好，所以選定LP4作為合成納米ZnO用菌株。

表1 植物乳桿菌在不同ZnSO4濃度MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況（OD600）Table 1 Growth of L.plantarum in MRS medium of different ZnSO4 concentration（maximum OD600）

2.2 生物法合成ZnO-NPs的表征

收集植物乳桿菌合成得到的白色沉淀，對(duì)其進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)、形貌和光學(xué)性質(zhì)的表征。圖1 為植物乳桿菌LP4 細(xì)胞和合成得到的白色沉淀物（即粗納米ZnO）煅燒前后掃描電鏡圖。由圖可見該植物乳桿菌菌體長(zhǎng)度為0.9～2.5 μm，表面潔凈無(wú)顆粒物[圖1(a)]。而合成粗產(chǎn)物為類球形顆粒狀，大小在幾到幾十個(gè)納米，產(chǎn)物中含有少量植物乳桿菌細(xì)胞[圖1(b)]。為了獲得純納米粒子，將合成粗產(chǎn)物600℃下煅燒3 h，使植物乳桿菌菌體細(xì)胞灰化干凈，將灰化后的灰白色粉末充分研磨后，于掃描電鏡下再觀察其形貌[圖1(c)]，煅燒后產(chǎn)物呈類球形，粒徑尺寸在100～300 nm，與煅燒前相比，顆粒尺寸有所增大，出現(xiàn)團(tuán)結(jié)現(xiàn)象，這主要是和樣品處理過(guò)程中冷凍干燥與煅燒退火有關(guān)[24]。

為了更精確分析得到的納米粒子的大小和形貌，對(duì)植物乳桿菌合成的ZnO-NPs 進(jìn)一步進(jìn)行了高分辨率透射電鏡測(cè)試（圖2）。圖2(a)為合成的粗產(chǎn)物透射電鏡圖，固體顆粒（ZnO-NPs）成團(tuán)聚集在菌體表面，顆粒尺寸為9～35 nm，菌體尺寸約為1.3 μm，可見菌體干燥過(guò)程中出現(xiàn)了一定程度的變形和收縮。將合成的粗產(chǎn)物煅燒去除菌體再進(jìn)行測(cè)試[圖2(b)]，產(chǎn)物ZnO 呈類球形結(jié)構(gòu)，結(jié)晶度良好，平均晶粒尺寸約為200 nm，有局部團(tuán)聚現(xiàn)象，顆粒尺寸明顯增大，這是樣品顆粒在煅燒退火熱處理過(guò)程中發(fā)生再結(jié)晶導(dǎo)致。在退火過(guò)程中，晶體內(nèi)部和表面原子通過(guò)熱運(yùn)動(dòng)到達(dá)格點(diǎn)位置，抑制了氧空位和鋅間隙的形成，導(dǎo)致部分晶粒間的晶界消失而生成大的晶粒[25]。

圖1 植物乳桿菌LP4細(xì)胞（a）、植物乳桿菌合成的粗ZnO-NPs（b）和煅燒后ZnO-NPs（c）掃描電鏡圖Fig.1 SEM micrograph of L.plantarum cells(a),crude ZnO-NPs synthesized by L.plantarum(b),and ZnO-NPs after calcination(c)

圖2 植物乳桿菌合成ZnO-NPs（a）與煅燒后（b）透射電鏡圖Fig.2 TEM micrograph of crude ZnO-NPs synthesized by L.plantarum(a)and ZnO-NPs after calcination(b)

圖3為植物乳桿菌合成ZnO-NPs X 射線衍射譜圖，譜圖中11 個(gè)衍射峰依次對(duì)應(yīng)晶格常數(shù)a=0.325 nm、c=0.521 nm 六 方 晶 系ZnO 的（100）、（002）、（101）、（102）、（110）、（103）、（200）、（112）、（201）、（004）、（202）相應(yīng)衍射面，所有的衍射峰均對(duì)應(yīng)于六方纖鋅礦結(jié)構(gòu)，表明植物乳桿菌合成的ZnO-NPs粒子是結(jié)晶良好的ZnO六方晶體。并且與ZnO粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)卡片相匹配。除ZnO 的衍射峰以外沒有出現(xiàn)其他衍射峰，說(shuō)明樣品的結(jié)晶度很高。納米ZnO 光學(xué)特性之一是在紫外線280～400 nm（近紫外區(qū)）有特征吸收，對(duì)可見光區(qū)域有很高的透過(guò)性[26]。對(duì)合成得到的納米氧化鋅進(jìn)行紫外可見光掃描，結(jié)果顯示在359 nm 處出現(xiàn)了吸收峰，并且沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，這也說(shuō)明合成的ZnO-NPs 粒子粒徑較小，均一度較高。

圖3 植物乳桿菌合成ZnO-NPs X射線衍射譜圖Fig.3 X-ray diffraction pattern of ZnO-NPs synthesized by L.plantarum

掃描、透射電鏡和X 射線衍射等分析測(cè)試表明植物乳桿菌LP4 成功合成了納米氧化鋅，但其合成機(jī)理尚有待于進(jìn)一步研究。一些研究表明納米粒子的合成與細(xì)菌分泌的一些蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)有關(guān)[14,27]，植物乳桿菌負(fù)的氧化還原電位對(duì)陽(yáng)離子（Zn2+）的吸引也助于納米粒子合成的引發(fā)。推測(cè)合成的化學(xué)機(jī)理見圖4，ZnO 對(duì)細(xì)菌形成一種應(yīng)激壓力，刺激其分泌一些蛋白或脂類物質(zhì)，這些物質(zhì)促使細(xì)胞表面ZnO 微核的形成和穩(wěn)定，而溶液中存在的少量[Zn(OH)4]2-促使ZnO 微核進(jìn)一步自聚集形成六方晶體結(jié)構(gòu)的ZnO納米粒子[27-28]。

圖4 植物乳桿菌合成ZnO-NPs的化學(xué)機(jī)理Fig.4 Chemical mechanism of synthesis of ZnO-NPs by L.plantarum

2.3 ZnO-NPs固定化假絲酵母脂肪酶及其性質(zhì)

固定化是酶工業(yè)應(yīng)用的一種關(guān)鍵技術(shù)，固定化載體改進(jìn)和開發(fā)是其研究重點(diǎn)之一。相對(duì)于普通的多孔無(wú)機(jī)載體和有機(jī)載體，納米材料用于酶固定化具有生物相容性好、擴(kuò)散阻力小、載酶量高和制得的固定化酶穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)勢(shì)[29]。物理或化學(xué)法等傳統(tǒng)法合成的納米粒子、納米管和納米纖維用于酶固定化已有許多研究[7,30]，但生物法合成納米粒子在固定化酶這方面的研究還未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用直接吸附法以植物乳桿菌LP4合成的ZnO-NPs作載體對(duì)功能多樣、應(yīng)用廣泛的Candidasp.脂肪酶[31-32]進(jìn)行固定化，優(yōu)化固定化條件并與普通氧化鋅和傳統(tǒng)法合成的ZnO-NPs 粒子固定化效果進(jìn)行比較，結(jié)果見圖5。生物法合成的ZnO-NPs 用于酶固定化表現(xiàn)理想，酶活收率分別比普通氧化鋅和傳統(tǒng)納米ZnO 提高了114.2%和20.5%。普通氧化鋅的酶活收率較低主要是因?yàn)槠湮搅ο鄬?duì)弱，酶固載率低導(dǎo)致的。生物法納米氧化鋅對(duì)酶的固載率與普通納米氧化鋅幾乎沒有差異，但固定化酶活收率卻明顯高于后者（圖5），主要原因可能與生物ZnO-NPs 表面包覆一些生物大分子有關(guān)。正如上文納米氧化鋅合成化學(xué)機(jī)理以及大量文獻(xiàn)報(bào)道[8,14,27]所述，生物合成的納米粒子表面裹有一些蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子，而非酶蛋白等大分子可有效改善固定化酶中酶分子作用微環(huán)境[33-35]，因此生物納米氧化鋅表現(xiàn)出高的表觀活性。

圖5 不同ZnO固定Candida sp.脂肪酶的比較Fig.5 Comparison of immobilized Candida sp.lipase on various types of ZnO

圖6 生物法ZnO-NPs固定化酶與游離酶的pH和熱穩(wěn)定性比較Fig.6 Stabilities of free lipase and immobilized lipase prepared by biosynthesized ZnO-NPs

圖6 是生物納米ZnO 固定脂肪酶和其游離酶的pH 和熱穩(wěn)定性比較，固定化酶的pH 穩(wěn)定性明顯高于游離酶[圖6(a)]，尤其在酸性條件下優(yōu)勢(shì)更為明顯：在pH=5 條件下放置2 h 的固定化酶活性相對(duì)于初始酶活降低了47.4%，而游離酶活降低了76%?？赡茉蚴羌{米粒子的多點(diǎn)吸附影響并穩(wěn)定了酶分子的空間結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了其抗酸堿的能力[36]。圖6(b)是固定化酶的熱穩(wěn)定性：在20～45℃任一溫度下放置2 h 后固定化酶的剩余活力都高于游離酶活力，可見該酶被生物ZnO-NPs 固定后熱穩(wěn)定提高明顯。

除了pH 和熱穩(wěn)定性，重復(fù)使用性能——操作穩(wěn)定性的高低也是評(píng)價(jià)固定化酶優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究以癸酸甘油酯的合成為模式反應(yīng)對(duì)生物納米固定化酶的操作穩(wěn)定行進(jìn)行了測(cè)定。癸酸甘油酯是一種重要的中鏈甘油酯，常用作嬰兒及腸胃吸收功能障礙患者的營(yíng)養(yǎng)品。圖7為固定化酶操作穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（實(shí)驗(yàn)條件已經(jīng)優(yōu)化），重復(fù)使用5 批次后該酶催化活性沒有明顯下降，癸酸的轉(zhuǎn)化率仍能維持90%左右，直到第7 批次催化活性才損失一半左右，與先前采用交聯(lián)酶聚集體法固定的脂肪酶重復(fù)使用性能相當(dāng)[2]，可見該生物納米吸附法固定化酶具有較好的穩(wěn)定性和催化活性。

3 結(jié) 論

圖7 生物ZnO-NPs固定化酶重復(fù)使用性能Fig.7 Reusability of immobilized lipase on biosynthesized ZnO-NPs

采用篩選得到的一種高耐Zn2+的植物乳桿菌成功合成了納米ZnO。掃描電鏡、透射電鏡和X 衍射等手段分析表明，生物合成的納米材料為9～35 nm的ZnO-NPs 粒子，其最大紫外可見吸收峰在359 nm，晶格呈現(xiàn)纖鋅礦結(jié)構(gòu)。將得到的納米粒子應(yīng)用于直接吸附法制備固定脂肪酶，固定化酶活收率分別比普通氧化鋅和納米氧化鋅高114.2%和20.5%。生物納米氧化鋅固定化酶的pH 和溫度穩(wěn)定性都得到明顯提高，而且具有較好的重復(fù)使用性能。微生物合成納米氧化鋅不僅合成過(guò)程綠色、無(wú)毒、環(huán)境友好，而且產(chǎn)物用于酶的固定化有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。