馮 磊 李 響 孟繁平 李 妍 (延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，延吉 133002)

血液中單核細(xì)胞被募集分布于組織成為巨噬細(xì)胞(macrophage)，組織微環(huán)境中巨噬細(xì)胞通過(guò)經(jīng)典極化的途徑和選擇性極化的途徑分別向M1型和M2型極化[1]。在細(xì)胞因子IFN-γ、病原體成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等刺激下，巨噬細(xì)胞向M1型極化，其細(xì)胞膜CD40、CD80和CD86等表達(dá)增加，并分泌促炎因子，抗病原體和抗腫瘤效應(yīng)增強(qiáng)。而M2型極化后CD40、CD80和CD86等表達(dá)減少，CD206表達(dá)增加；其抗原提呈和介導(dǎo)炎癥活性下降，免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織修復(fù)作用增強(qiáng)[2]。M1型和M2型是活化巨噬細(xì)胞的兩個(gè)極端狀態(tài)，其分化受到復(fù)雜環(huán)境的調(diào)節(jié)。M2 型可再極化為M1 型，反之亦然。腫瘤微環(huán)境中(tumor microenvironment，TME)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophage，TAM)傾向于M2型極化，分泌TGF-β、IL-10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)等細(xì)胞因子[3]。研究表明，局部TAM數(shù)量多與腫瘤患者癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)快、生存期短密切相關(guān)[4]。篩選逆轉(zhuǎn)M2極化的制劑，對(duì)干預(yù)TAM分化，輔助腫瘤治療具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)炙甘草的中等分子量多糖(medium molecular weight polysaccharide from roasted radixglycyrrhizae,MPRR)具有較強(qiáng)活化巨噬細(xì)胞的作用[5]。本研究通過(guò)探討IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化，并檢測(cè)MPRR對(duì)其再極化的調(diào)節(jié)，闡明不同極化型巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞和小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞引自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品保藏中心。胎牛血清購(gòu)自黃巖四季青有限公司。1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司。藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記抗體(CD86、CD206 )和PE標(biāo)記同型對(duì)照抗體購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)有限公司。羧基化聚苯乙烯熒光微球 (fluospheres carboxylate yellow-green 505/515)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。IL-4購(gòu)自北京義翹科技有限公司。ELISA試劑盒(檢測(cè)小鼠IFN-γ和TGF-β)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。小鼠 STAT-6抗體、磷酸化STAT-6(Tyr641)抗體、β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。牛血清白蛋白(BSA)、噻唑藍(lán)(MTT)和碘化丙啶(PI)等購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。蛋白電泳和免疫印跡相關(guān)緩沖液購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。采用水提和醇沉法制備炙甘草多糖，采用超濾離心法制備炙甘草的中等分子量多糖(MPRR)[6]。用1640培養(yǎng)液溶解IL-4(50 μg/ml),分裝后-20℃保存；1640培養(yǎng)液溶解MPRR(5 mg/ml)，過(guò)濾除菌并分裝后-20℃保存。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 自液氮中取出凍存RAW264.7 細(xì)胞和4T1細(xì)胞，復(fù)蘇后用含10%小牛血清1640培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)。消化液(0.25%胰蛋白酶和 0.2%乙二胺四乙酸)消化后傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析 接種細(xì)胞于6孔板，加入不同濃度IL-4(0、12.5、25、50和100 ng/ml)，培養(yǎng)12 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，采用直接免疫熒光，法檢測(cè)CD86和CD206的表達(dá)。即200 μl含0.5% BSA 溶液重懸細(xì)胞(細(xì)胞總數(shù)約為1×106個(gè))，加入抗體1 μg(PE標(biāo)記抗CD86、CD206或同型對(duì)照抗體)，避光染色30 min。PBS洗滌細(xì)胞2次，轉(zhuǎn)入流式管后上機(jī)檢測(cè)。以膜分子表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分率代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相同方法分析其他處理因素作用后CD86和CD206表達(dá)。

1.2.3吞噬功能檢測(cè) 收集不同處理因素作用后的細(xì)胞，每組細(xì)胞數(shù)為(1～2)×106個(gè)，細(xì)胞與2 μl羧基化聚合苯乙烯熒光微球(細(xì)胞與微球的比例為1∶25～1∶100)孵育2 h后收集細(xì)胞，洗滌3次后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光，發(fā)射綠色熒光的細(xì)胞為吞噬熒光微球的細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞百分率代表吞噬效應(yīng)的強(qiáng)度。

1.2.4免疫印跡實(shí)驗(yàn) 接種RAW264.7細(xì)胞于6孔板，按如下分組進(jìn)行處理。M0組(以培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞12 h，更換新培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)12 h)，M2組(50 ng/ml IL-4 誘導(dǎo)細(xì)胞12 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h)，MPRR組(100 μg/ml MPRR 誘導(dǎo)12 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h)，Rp組(50 ng/ml IL-4 誘導(dǎo)12 h，洗滌細(xì)胞2次，100 μg/ml MPRR 誘導(dǎo)12 h)。收集不同處理因素誘導(dǎo)后細(xì)胞，PBS洗滌2次；末次離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量試劑盒測(cè)定各組樣品的蛋白濃度，并調(diào)為濃度一致；加入上樣緩沖液后水浴煮沸5 min，分裝蛋白樣品并冷凍保存。將蛋白樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；通過(guò)轉(zhuǎn)膜電泳將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫下封閉2 h，洗滌3次后將膜與稀釋的一抗在4℃下反應(yīng)過(guò)夜。次日洗滌PVDF膜3次，將膜與稀釋的HRP標(biāo)記二抗在室溫下反應(yīng)2 h。洗滌3次后與ECL發(fā)光工作液反應(yīng)2 min，用凝膠成像系統(tǒng)曝光照相記錄結(jié)果。

1.2.5細(xì)胞因子含量檢測(cè) 接種細(xì)胞于6孔板，按M0組、M2組、MPRR組和Rp組進(jìn)行處理。消化液處理并收集細(xì)胞，洗滌2次后按相同密度接種細(xì)胞于6孔板，以不含IL-4或MPRR的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集上清液并用0.22 μm無(wú)菌針頭過(guò)濾器過(guò)濾后分裝保存；采用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清液IFN-γ和TGF-β的含量。

1.2.6細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè) 接種4T-1于96孔板，對(duì)照組每孔加入200 μl；實(shí)驗(yàn)組加入150 μl 培養(yǎng)液，并分別加入不同處理組的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液(M0組、M2組、MPRR組和Rp組)50 μl，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，用MTT還原法檢測(cè)72 h后細(xì)胞增殖變化。檢測(cè)前4 h，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入200 μl 二甲基亞砜溶解細(xì)胞內(nèi)還原產(chǎn)物甲臜，檢測(cè)490 nm吸光度值(A490)，以各組A490均值代表不同處理因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

2 結(jié)果

2.1IL-4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)極化巨噬細(xì)胞CD86和CD206的表達(dá) 流式細(xì)胞術(shù)分析RAW264.7細(xì)胞在IL-4和MPRR的作用下，其CD86和CD206表達(dá)變化，隨IL-4濃度增加，CD86陽(yáng)性細(xì)胞的百分率下降(P<0.05)，而CD206陽(yáng)性細(xì)胞的百分率增加(P<0.05)；伴隨MPRR濃度增加促進(jìn)CD86的表達(dá)(P<0.05)，但CD206陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)下降(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M2極化巨噬細(xì)胞再極化后CD86和CD206的表達(dá) M0組(對(duì)照組)、M2組(M2極化組)、MPRR(極化組) 和Rp組(再極化組)的CD86和CD206表型分析， 與M0組比較，M2極化組 CD86表達(dá)減少(P<0.05)和CD206 表達(dá)增加(P<0.05)，MPRR組CD86表達(dá)增加而CD206表達(dá)減少(P<0.05)；與M2極化組比較，再極化組CD86表達(dá)增加而CD206表達(dá)減少(P<0.05)，見(jiàn)表2。

GroupsDoseCD86CD206IL-4(ng/ml)061.01±4.38 9.56±2.6212.559.81±4.4610.89±1.662555.38±3.651)15.16±2.411)5054.31±4.791)18.38±3.681)10052.32±4.181)21.23±3.451)MPRR(μg/ml)2563.30±3.531)9.68±2.305066.07±5.061)7.03±2.261)10069.67±3.751)6.32±2.141)20070.30±3.801)5.84±1.811)

Note:Compared with IL-4 0 ng/ml,1)P<0.05.

如圖1所示，采用免疫印跡法分析轉(zhuǎn)錄因子STAT-6表達(dá)和磷酸化的變化。各組細(xì)胞STAT-6表達(dá)無(wú)明顯變化；M0組STAT-6磷酸化極低，與M0組比較，M2組細(xì)胞STAT-6磷酸化顯著增強(qiáng)；與M2組比較，再極化組磷酸化STAT-6(Tyr641)明顯下降。

2.3M2極化巨噬細(xì)胞再極化后吞噬功能分析 收集不同條件誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞，檢測(cè)M0組、M2組、MPRR組和Rp組細(xì)胞對(duì)熒光微球的吞噬，結(jié)果見(jiàn)表3。與M0組比較，M2極化組吞噬率下降(P<0.05)，MPRR組吞噬效應(yīng)增強(qiáng)(P<0.05)；再極化組(Rp)的吞噬效應(yīng)強(qiáng)于M2極化組(P<0.05)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)上清中IFN-γ和TGF-β的水平 收集不同條件誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清，檢測(cè)M0組、M2組、MPRR組和Rp組IFN-γ和TGF-β的濃度。與M0組比較，M2極化組IFN-γ表達(dá)減少(P<0.05)和TGF-β表達(dá)增加(P<0.05)，MPRR組IFN-γ表達(dá)增加而TGF-β表達(dá)減少(P<0.05)；與M2極化組比較，再極化組IFN-γ和TGF-β的表達(dá)均增加(P<0.05)，見(jiàn)表4。

GroupsCD86CD206M061.77±4.799.78±1.36M254.64±3.711)17.64±2.381)MPRR68.88±3.591)6.72±1.561)Rp61.26±3.302)10.51±1.712)

Note:Compared with M0 group,1)P<0.05;compared with M2 group,2)P<0.05.

圖1 MPRR對(duì)M2極化細(xì)胞STAT-6表達(dá)和磷酸化的影響Fig.1 Effect of MPRR on expression and phosphorylation of STAT-6 in M2-polarized cells

GroupsIFN-γM062.6±4.8M253.3±5.41)MPRR71.5±6.61)Rp65.1±7.62)

Note:Compared with M0 group,1)P<0.05;compared with M2 group,2)P<0.05.

GroupsIFN-γTGF-βM0514.8±21.6115.0±14.4M2249.4±26.31)245.4±25.91)MPRR591.6±25.21)90.6±12.81)Rp434.1±31.72)327.1±29.72)

Note:Compared with M0 group,1)P<0.05;compared with M2 group,2)P<0.05.

2.5巨噬細(xì)胞不同條件培養(yǎng)上清液對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 以新鮮培養(yǎng)液為對(duì)照，MTT還原法檢測(cè)不同的條件培養(yǎng)上清對(duì)4T1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。M0組OD值為1.072±0.093，M2組OD值為1.482±0.086，MPPR組OD值為0.955±0.057，Rp組OD值為1.243±0.063。與M0組比較，M2組上清液OD值升高，MPPR組上清液OD值指標(biāo)下降(P<0.05)；與M2組比較，Rp組上清液OD值下降(P<0.05)。

3 討論

體內(nèi)微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可發(fā)生表型極化，而其功能也因不同極化而變化。靜息或未分化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞(M0)可在 IFN-γ(活化Th1分泌)和LPS 誘導(dǎo)下向 M1 型轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)錄因子STAT-1、NF-κB和AP-1轉(zhuǎn)位入核，調(diào)節(jié)IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、一氧化氮合酶和多種趨化因子產(chǎn)生，其細(xì)胞膜CD40、CD80和CD86的表達(dá)增強(qiáng)。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)募集DC、NK和Th1，增強(qiáng)對(duì)病原體和腫瘤的免疫應(yīng)答，NO和IFN-γ參與對(duì)腫瘤細(xì)胞和病原體的殺傷[6,7]。IL-4和IL-13(Th2等分泌)等細(xì)胞因子均可促進(jìn)M2極化，M2高表達(dá)CD206、精氨酸酶 1(arginase 1,Arg1)，分泌TGF-β、IL-4、IL-10、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)和VEGF等，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和組織修復(fù)，促進(jìn)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。依據(jù)刺激物和功能不同，M2極化被細(xì)分為 M2a、M2b 和 M2c，M2a為T(mén)h2樣細(xì)胞因子誘導(dǎo)，是最早闡述的M2型極化[8]。M2b和M2c被稱為M2樣極化，Toll樣受體(或IL-1受體)信號(hào)與免疫復(fù)合物誘導(dǎo)M2b極化，而IL-10和TGF-β或糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)M2c極化[9]。就細(xì)胞表面標(biāo)志而言，巨噬細(xì)胞M1極化后CD40、CD80和CD86的表達(dá)增強(qiáng)；而M2極化表型通常伴隨CD206表達(dá)增加[10]。

M1和M2極化受到細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號(hào)的復(fù)雜調(diào)節(jié)。體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ 主要通過(guò)激活JAKs-STATs 信號(hào)通路而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，IFN-γ主要激活STAT1[11]。外源性誘導(dǎo)因子細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)主要通過(guò)TLR4-PI3K-NF-κB 信號(hào)通路促進(jìn)M1極化。炎癥刺激、細(xì)胞應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)成分也可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB促進(jìn)M1極化，其信號(hào)經(jīng)由PI3K、AKT和mTOR激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)。AKT/PKB和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K下游蛋白激酶分子。AKT即蛋白激酶B(proteinkinase B，PKB)家族有3個(gè)成員(AKT1、AKT2和AKT3)。單核細(xì)胞內(nèi)AKT1由PI3K通過(guò)髓樣細(xì)胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1)激活，維持巨噬細(xì)胞存活，AKT1活化強(qiáng)于AKT2時(shí)，巨噬偏向于M2極化[12]。AKT1基因敲除引起M1極化；而AKT2基因敲除引起M2極化。絲/蘇氨酸蛋白酶mTOR是偶聯(lián)能量供給、糖酵解和細(xì)胞脂類合成的調(diào)節(jié)點(diǎn)，結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體1和2(tuberous sclerosis complex,TSC1/2) 對(duì)其進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。TSC1/2活性下降，則mTOR復(fù)合物1(mTOR complex1,mTORC1)活化加強(qiáng)，巨噬細(xì)胞釋放炎癥性細(xì)胞因子增加。蛋白激酶JNK是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)超家族成員，肥胖者脂肪組織中JNK激酶活性增強(qiáng)，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1促進(jìn)M1極化[13]。Notch 受體(Notch1～4)和配體參與巨噬細(xì)胞極化調(diào)節(jié)，Notch1信號(hào)通過(guò)促進(jìn) NF-κB輔助TLR4促進(jìn)M1極化。IL-4和IL-13 與巨噬細(xì)胞的受體 IL-4Rα結(jié)合，主要通過(guò)JAK-STAT6 信號(hào)通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 極化。STAT6 缺失下，IL-4不能抑制 MIG的表達(dá)。STAT6 激活過(guò)氧化物酶增殖物激活受體-γ (peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR-γ)可促進(jìn)Arg-1等M2特征性標(biāo)志物表達(dá)。TGF-β也可通過(guò)JAK/STAT途徑促進(jìn) M2極化[14]。概括而言，轉(zhuǎn)錄因子STAT6對(duì)巨噬細(xì)胞M2極化至關(guān)重要，STAT6 抑制 STAT1，避免向M1型TAMs活化，抑制促炎細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α等產(chǎn)生。STAT6磷酸化激活后，促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)因4(interferon regulatory factor 4，IRF4) 轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)M2相關(guān)基因表達(dá)。

腫瘤組織中募集了大量巨噬細(xì)胞，并趨向M2極化。腫瘤微環(huán)境中Th2樣細(xì)胞因子(IL-4、IL-13和IL-10)，誘導(dǎo)TAM向M2極化，乳腺癌、卵巢癌肺癌等多種腫瘤細(xì)胞也分泌IL-4、IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)腫瘤組織中TAM向M2極化。研究表明，腫瘤組織中M2型細(xì)胞主要富集于缺氧區(qū)域，M1 型巨噬細(xì)胞則位于常氧區(qū)域。低氧誘導(dǎo)因子2α(hypoxia inducible factor 2α，HIF2α)參與實(shí)體瘤TAM誘導(dǎo)，TAM具有M2特征，不僅Arg1酶表達(dá)增加，NO等自由基減少，且VEGF、EGF和MMP-9表達(dá)增加[15]。腫瘤相關(guān)的表觀遺傳學(xué)變化和代謝產(chǎn)物參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)，在缺氧的TAE中，巨噬細(xì)胞和腫瘤可發(fā)生代謝重編程，更多地依賴有氧糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)換為能量。腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解可低效提供ATP，并伴隨乳酸等代謝產(chǎn)物增加，但代謝產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞骨架、蛋白和脂質(zhì)的合成，有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[16]。腫瘤微環(huán)境中TAM和癌細(xì)胞具有相似的表觀遺傳學(xué)變化，糖酵解形成的乳酸等產(chǎn)物可通過(guò)多種表觀遺傳學(xué)效應(yīng)促進(jìn)M2極化，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調(diào)控[17]。甲基化轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，DNMT)催化DNA與甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，腫瘤組織細(xì)胞和TAM均發(fā)現(xiàn)因DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表達(dá)下降，而導(dǎo)致DNA低甲基化，進(jìn)而促進(jìn)M2極化。組蛋白修飾主要包括其甲基化、泛素化、乙酰化、磷酸化和ADP-核糖基化等，組蛋白甲基化Smyd2通過(guò)減少抑制IL-6和TNF-α表達(dá)，抑制M1極化；多種組蛋白修飾可通過(guò)促進(jìn)Th2樣細(xì)胞因子表達(dá)使TAM向M2極化。

減少或逆轉(zhuǎn)TAM向M2型極化，對(duì)抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移有重要意義。盡管巨噬細(xì)胞極化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜，TAM向M2極化主要受Th2樣細(xì)胞因子、代謝重編程和表觀遺傳機(jī)制的影響，理論而言是可逆轉(zhuǎn)和可調(diào)節(jié)的。有學(xué)者提出，M2b和M2c是M1型向M2型轉(zhuǎn)化的過(guò)度，通過(guò)促進(jìn)M1極化可減少M(fèi)2極化。免疫調(diào)節(jié)是真菌和植物多糖重要的藥理學(xué)活性。Th2和M2型巨噬細(xì)化參與哮喘發(fā)病，富含多糖的中藥湯劑炙甘草湯和四君子湯等常用于哮喘的治療，伴隨癥狀緩解，可發(fā)現(xiàn)局部組織中STAT6磷酸化減少[18，19]。前期工作中提取并分離不同分子量的水溶性炙甘草多糖，發(fā)現(xiàn)水溶性炙甘草的中等分子量多糖(MPRR)具有較強(qiáng)活化巨噬細(xì)胞的作用，能促進(jìn)IFN-γ釋放，減少TGF-β釋放。為進(jìn)一步研究MPRR是否可逆轉(zhuǎn)M2極化，本研究采用IL-4誘導(dǎo)小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞，M2極化細(xì)胞IFN-γ分泌減少，CD86表達(dá)下降；而TNF-β分泌增加，CD206表達(dá)增加；將MPRR用于M2極化的巨噬細(xì)胞可減少CD206表達(dá)，促進(jìn)CD86表達(dá)，增加IFN-γ分泌而減少TNF-β分泌。對(duì)STAT6表達(dá)和磷酸化分析，IL-4 促進(jìn)STAT6(pTyr641)，而MPRR可減少M(fèi)2極化細(xì)胞內(nèi)STAT6磷酸化。概括而言，MPRR可逆轉(zhuǎn)IL-4誘導(dǎo)的M2極化。MPRR也參與對(duì)巨噬細(xì)胞極化后吞噬功能的調(diào)節(jié)，其單獨(dú)作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能，誘導(dǎo)M2極化細(xì)胞再極化后也伴隨對(duì)其吞噬效應(yīng)的增強(qiáng)。

腫瘤局部Th2通過(guò)釋放細(xì)胞因子促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而M2極化TAM不僅增加Th2樣細(xì)胞因子來(lái)源，并可通過(guò)MMP-9和VEGF等促進(jìn)血管和淋巴管重塑；乳腺癌等腫瘤可釋放IL-10和TGF-β，參與腫瘤微環(huán)境中Th2偏移和TAM 向M2極化。除免疫細(xì)胞外，上皮細(xì)胞或乳腺癌等上皮源性腫瘤細(xì)胞也表達(dá)IL-4、IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子的受體，Th2和M2極化細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]。本研究表明，M2極化巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液可促進(jìn)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞增殖，而MPRR誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞的旁分泌作用對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用；MPRR逆轉(zhuǎn)M2(IL-4誘導(dǎo))極化后，也減弱其旁分泌促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)。減少腫瘤微環(huán)境中M2型極化對(duì)減少炎-癌間的互相促進(jìn)有重要意義。

概括而言，采用真菌和植物多糖不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，提示其可能通過(guò)對(duì)巨噬細(xì)胞 TAM極化的調(diào)節(jié)而一定程度改變有利腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境。體內(nèi)真實(shí)的腫瘤微環(huán)境中多種免疫細(xì)胞、組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞自身均可分泌細(xì)胞因子，影響免疫細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞表型。在體外研究的基礎(chǔ)上，尚需要通過(guò)體內(nèi)研究來(lái)證實(shí)其免疫調(diào)節(jié)的活性。