李 悅 尹秀艷 劉婉露 祁麗麗 (牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，牡丹江 157011)

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，每年以2%～3%的速度增長，預(yù)計到2020年，全球患惡性腫瘤的人數(shù)將高達2 000萬，致死率將達60%[1，2]。惡性腫瘤具有生長快、易出血、易復(fù)發(fā)等特點，目前治療方式主要是手術(shù)切除、化療、放療、靶向藥物治療、免疫治療以及中醫(yī)中藥治療[3，4]。

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，初診時就有約20%患者發(fā)生轉(zhuǎn)移，約30%患者在術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]。腎癌是強免疫性腫瘤，術(shù)后干預(yù)是重要的輔助治療手段，免疫治療是腎癌術(shù)后干預(yù)的主要手段[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN和IL-2對腎癌的轉(zhuǎn)移有效，但治愈率偏低，并不能有效延長患者的生存期[7]。如何降低腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者預(yù)后，一直是腎癌治療的棘手問題[8]。研究發(fā)現(xiàn)DC-CIK細胞免疫治療法對腎癌術(shù)后的輔助治療具有很好的療效[9]。

樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是人體內(nèi)功能最強大的抗原呈遞細胞(antigen presenting cells,APC)，誘導(dǎo)抗原特異性細胞T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)形成，提高人體免疫力[10]。細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer cells,CIK)是體外通過多種細胞因子培養(yǎng)人外周血中單個核細胞從而獲得的一群異質(zhì)細胞，具有T淋巴細胞的強大抗腫瘤活性，同時具有非限制性殺傷腫瘤的特點[11]。體內(nèi)回輸免疫活細胞的免疫療法是腎癌腫瘤治療中重要的輔助治療方法[12]。腎癌術(shù)后，在患者體內(nèi)回輸DC和CIK細胞，能夠產(chǎn)生大量T淋巴細胞，增加機體免疫力，殺傷腫瘤細胞，達到對腎癌的術(shù)后干預(yù)治療，抑制腫瘤細胞復(fù)發(fā)[13]。DC和CIK是免疫治療的兩個部分，前者是通過刺激T淋巴細胞的產(chǎn)生，使機體獲得免疫能力，后者是通過自身的細胞毒性和分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，將二者有效結(jié)合，能夠產(chǎn)生雙重免疫療效[14]。

目前研究認為，抗腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)是產(chǎn)生T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，而在控制免疫原性腫瘤細胞的生長中，CD8+T淋巴細胞是產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要細胞，CD4+T細胞主要是通過分泌各種細胞因子來輔助、誘導(dǎo)并激活CD8+CTL細胞，CD3+T細胞是CIK細胞的主要異質(zhì)細胞群[15]。免疫應(yīng)答反應(yīng)中CD8+是抑制性T細胞，抑制免疫應(yīng)答，CD4+是輔助性T細胞，而CD3+則為成熟T細胞[16]。因此，檢測腎癌患者外周血T細胞亞群的變化和體內(nèi)細胞因子含量的變化對了解機體的免疫功能狀況具有重要作用。

1 資料與方法

1.1資料 術(shù)后隨訪我院2016年9月到2018年9月確診的60例腎癌患者，年齡32～78歲，平均年齡(49.3±7.5)歲，男34例，女26例。其中開放手術(shù)30例，腹腔鏡手術(shù)30例；腎癌根治性切除手術(shù)42例，保留腎單位手術(shù)18例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)對腫瘤的TNM分期標準，60例患者中T1N0M0期患者38例，T2N0M0期患者22例；左側(cè)腎癌28例，右側(cè)腎癌31例，雙側(cè)腎癌1例。對其進行DC-CIK細胞免疫治療前，對患者的腹部B超、胸部和腹部CT、肝功和腎功檢測、血常規(guī)和尿常規(guī)、外周血淋巴細胞亞群以及外周血相關(guān)細胞因子等情況進行評估。在患者身體確定無任何異常后，進行DC-CIK細胞免疫治療。DC-CIK細胞免疫治療經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且患者本人知情同意。

1.2方法

1.2.1采血 對參加免疫療法的患者進行造血動員，堅持服用GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，沙格司亭)75 g，2次/d。實時監(jiān)測外周血白細胞情況，當淋巴細胞和單核細胞數(shù)量之和達到2×109/L時采血，采血量約100 ml。

1.2.2DC誘導(dǎo)培養(yǎng) Ficoll法分離外周血單個核細胞(PBMC)，RPMI1640培養(yǎng)基中2×106個/ml重懸。37℃孵育90 min，加入10%的AB血清(100 ng/ml rhGM-CSF和50 ng/ml rhIL-4)并洗去未貼壁細胞。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，換掉1/3的細胞培養(yǎng)液，及時補充細胞因子。第5天，用10%的AB血清重懸RPMI1640培養(yǎng)基，細胞濃度調(diào)整為1×106個/ml，按照DC與抗原濃度比例3∶1 加入腫瘤細胞抗原，共培養(yǎng)24 h，加入細胞因子IL-1β、IL-6、PGE-2和TNF-α，終濃度分別為10 ng/ml、20 ng/ml、0.5 ng/ml、10 ng/ml。誘導(dǎo)24 h。將成熟的DC細胞重懸到2 ml生理鹽水中，4℃保存用于后續(xù)注射。

1.2.3DC細胞注射 在腹股溝大腿內(nèi)側(cè)兩側(cè)注射1 ml DC細胞懸液，每周1次，連續(xù)注射兩周。每次注射完成后，觀察45 min，無任何異常后方能離開。

1.2.4CIK細胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 將外周血中沒有貼壁生長的單個核細胞收集后，用10%AB血清重懸到RPMI1640培養(yǎng)基中，細胞濃度為2.5×106個/ml。鋪到含有anti-CD3mAb和IFN-γ(1 000 U/ml)的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。第2天，添加生長因子IL-1α(10 ng/ml)和IL-2(250 U/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。第3天，實時添加RPMI1640培養(yǎng)液并觀察細胞狀態(tài)。

1.2.5CIK回輸方案 每次CIK回輸前24 h，檢測CIK細胞，確定無污染后，將CIK細胞培養(yǎng)7～11 d，離心收集細胞。生理鹽水洗滌3次后，用含有患者10%血漿的生理鹽水重懸細胞，總體積約100 ml，2 h內(nèi)通過靜脈滴注的方式將其回輸給患者，確保每次回輸細胞數(shù)約(5.0±0.5)×108個，每個患者共滴注5次。

1.2.6相關(guān)指標評估 ①相關(guān)免疫功能指標檢測：在治療前一周和治療后兩周，采取患者外周血，用流式細胞儀法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)分別檢測患者T淋巴細胞亞群和相關(guān)細胞因子的含量。②肝功和腎功指標檢測：分別于治療前和治療后檢測患者肝功和腎功常規(guī)指標的變化。③生活質(zhì)量評估：按照Kamofsky評分標準評估患者治療前和治療后的生活質(zhì)量情況，評分標準為：100分，正常，無癥狀；90分，基本正常，有輕微癥狀；80分，勉強正常，有一些癥狀；70分，生活勉強自理，但是已經(jīng)無法維持正常生活；60分，生活大部分還可以自理，但是偶爾需要別人幫助；50分，生活大部分都需要別人照顧；40分，生活不能自理，需要別人的照顧和幫助；30分，生活已經(jīng)嚴重不能自理；20分，病重，需要住院治療；10分，病危，接近死亡；0分，死亡。④毒副反應(yīng)觀察：治療期間密切觀察患者是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，包括發(fā)熱、嘔吐、皮疹等。

2 結(jié)果

2.1外周血中T淋巴細胞亞群百分比 取患者治療前一周和治療后兩周外周血，測定外周血中T淋巴細胞亞群的百分比，結(jié)果如表1所示，CD3+、CD4+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值增高，CD8+T淋巴細胞百分比下降。

2.2外周血中細胞因子含量 取患者治療前一周和治療后兩周外周血，測定外周血中細胞因子含量變化，結(jié)果如表2所示，細胞因子IL-2和IFN-γ的含量增加，IL-10的含量減少。

2.3患者生活質(zhì)量評估 治療前，患者Kampfsky評分為(77.63±11.32)分，治療后患者Kampfsky評分為(85.28±12.57)分，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療后患者的生活質(zhì)量提高。

2.4患者不良反應(yīng) 治療過程中，大部分患者無任何不良反應(yīng)。7例患者出現(xiàn)低熱，且都在4 h內(nèi)自動退熱，無高熱患者出現(xiàn)。2例患者出現(xiàn)輕微肌肉酸痛，都在耐受范圍內(nèi)，未作特殊處理。1例患者出現(xiàn)血壓升高，處理后恢復(fù)正常。沒有嘔吐、肺水腫等情況。

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的腎癌患者在早期診斷時就可以發(fā)現(xiàn)，但還有20%～30%的患者在早期診斷時就已發(fā)生轉(zhuǎn)移，甚至還有相當一部分患者在手術(shù)治療后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[17]。全球每年新增20萬左右腎癌患者，病死率為50%～60%[18]。

LymphocyteBefore treatmentAfter treatmentP valueCD3+60.2±1.5567.4±0.890.019CD4+26.1±1.2837.6±0.540.026 CD8+25.3±1.7321.6±0.960.031CD4+/CD8+1.04±0.251.74±0.480.012

CytokineBefore treatmentAfter treatmentP valueIL-213.24±1.5118.42±0.890.005 9IFN-γ6.73±1.3512.36±1.590.008 2 IL-1015.46±1.3812.74±1.450.009 1

腎癌的治療主要以外科手術(shù)為主，同時，根據(jù)進展期腎癌的具體臨床特點，再加以細胞因子療法、放療、化療、分子靶向治療、生物免疫治療等相應(yīng)的的輔助治療[19]。這些方式雖然能夠提高患者的存活率，但是副作用大，且復(fù)發(fā)性強。

DC是指一類具有典型樹突狀形態(tài)，能夠移行至淋巴器官并刺激初始型T細胞增殖活化，具有相對特異性表面物質(zhì)的一類細胞，也是目前體內(nèi)抗原遞呈能力最強的抗原遞呈細胞[20]。DC能夠分泌多種細胞因子，如IFN-α等，能夠誘導(dǎo)CTL，直接或間接影響B(tài)淋巴細胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)DC可能通過以下途徑發(fā)揮抗腫瘤作用：①吞噬凋亡或壞死細胞；②被活化后的DC，能夠表達TNF家族的細胞因子；③直接抑制腫瘤細胞增殖；④增強NK和巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的功能[21]。

CIK細胞是由多種細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的非特異性殺傷細胞，能夠產(chǎn)生大量的細胞因子(如IL-4、IFN等)，從而抑制或殺傷腫瘤細胞[22]。CIK細胞還可以促使Fas基因及Fas基因的配體合成[23]。正常情況下，CIK細胞對正常骨髓的細胞毒性小，在機體免疫系統(tǒng)和功能不受到損傷的前提下，CIK細胞還可以直接殺傷腫瘤[24]。

DC和CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)所產(chǎn)生的細胞群體比單獨CIK細胞具有更強的增殖活性，可同時提高DC及CIK細胞的功能[25]。近年來，DC-CIK細胞免疫治療法應(yīng)用增多，具有安全、副作用小等優(yōu)點[26]。

本研究中，患者在輸入DC和CIK細胞之前，先采集一份外周血中的單核細胞和淋巴細胞，加入相應(yīng)的活性因子，分別單獨培養(yǎng)擴增，當細胞數(shù)量達到相應(yīng)的數(shù)量級后，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)；整個治療期間，DC共注射2次，每周一次，CIK細胞共滴注5次，每隔一天滴注一次；這種輸注方式等同于建立了一定量的DC和CIK共培養(yǎng)體系，提高了細胞毒效應(yīng)，使得機體的先天和后天免疫反應(yīng)均被啟動，提高了殺傷性和特異性，對于腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)起到了延緩或阻止作用。因此，本研究中將DC與CIK細胞聯(lián)合培養(yǎng)應(yīng)用于腎癌的輔助治療，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，腎癌患者接受DC-CIK聯(lián)合細胞療法后，CD3+、CD4+T細胞增加(P<0.05)，CD8+T細胞減少(P<0.05)，同時相關(guān)的細胞因子IL-2、IFN-γ含量增加(P<0.01)，證明DC-CIK細胞免疫療法能更好地激發(fā)機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，提高患者免疫力，改善患者生存質(zhì)量。這種生物免疫療法毒性低、治療效果好，是未來抗腫瘤治療的重要發(fā)展方向。

但是，本研究仍然面臨很多問題。第一，所有患者都采用同一套實驗方法，對于特殊患者來說，有效率可能大大降低。在將來的研究中，應(yīng)該思考如何根據(jù)患者的腫瘤細胞特征，確定個體化免疫治療方案。第二，對患者生存質(zhì)量評估，主要是實地觀察，患者及患者家屬的訪談，帶有一定不確定性，具有誤差。在將來的研究中，應(yīng)該設(shè)計更為縝密的實驗方案，降低誤差。