陳樹俊 - 羅 佳

(山西大學生命科學學院，山西 太原 030006)

開菲爾屬于益生菌發(fā)酵乳，發(fā)酵菌種為開菲爾?；蜷_菲爾菌，開菲爾菌由乳酸菌和酵母菌的某些屬種組成[1]。何雪暢等[2]研究發(fā)現，開菲爾制品具有緩解乳糖不耐癥、抑制病原菌、改善消化機能、刺激免疫系統(tǒng)和降低膽固醇水平等功效。

近年來，營養(yǎng)豐富、風味獨特的復合果蔬制品已成為人們青睞的健康食品。目前市場上的發(fā)酵果蔬產品發(fā)酵菌種單一、果蔬原料單調[3]；有關開菲爾菌的研究多為乳制品[4]，例如，陳培康[5]曾將從開菲爾粒中分離的克魯維酵母與植物乳桿菌接入馬鈴薯、牛奶中進行發(fā)酵，制得酒味協(xié)調、香氣宜人且口感清爽的開菲爾馬鈴薯發(fā)酵乳酒。目前未見有研究者將Kefir接入非乳制品中進行發(fā)酵。試驗擬以開菲爾發(fā)酵劑發(fā)酵蘋果漿—番茄醬—沙棘原汁復合果蔬，再添加一定量的菊粉、低聚果糖和麥綠素，并經真空冷凍干燥制作一種營養(yǎng)豐富、功能獨特的新型開菲爾產品。旨在探索復合果蔬發(fā)酵工藝，以及對添加菊粉、低聚果糖和麥綠素再經凍干后的固體飲品進行體外降糖、降脂和抗氧化功能評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果漿、番茄醬：青島福得味食品有限公司；

沙棘原汁：山西野山坡食品有限公司；

開菲爾發(fā)酵劑(乳酸菌∶酵母菌數量比約為3∶1)：山西大學生命科學學院；

氫氧化鈉：分析純，天津市大陸化學試劑廠；

乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS)、酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)、瓊脂、α-淀粉酶(3 700 U/g)、牛膽酸鈉、胰蛋白酶(250 U/mg)：北京索萊寶科技有限公司；

DPPH：美國Sigma公司；

試驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

電子臺秤：ACS-15型，長治市青鸞衡器有限公司；

隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱：PYX-DHS-50X65-S-Ⅱ型，上海躍進醫(yī)療器械廠；

真空冷凍干燥成套設備：TFDS25型，煙臺中孚冷鏈設備有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-5100型，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

Kefir發(fā)酵劑→活化→果蔬復配→調節(jié)pH→殺菌→冷卻→接種→保溫發(fā)酵→調配→預凍→凍干→產品

(1) 果蔬復配：通過預試驗確定蘋果漿∶番茄醬∶沙棘原汁按質量比15.0∶4.0∶3.5進行復配，并攪拌均勻。

(2) 調節(jié)pH：用小蘇打水調節(jié)果蔬漿pH至4.7，封口。

(3) 殺菌：90 ℃恒溫殺菌20 min。

(4) 開菲爾發(fā)酵劑活化：將開菲爾發(fā)酵劑加入到15倍體積的新鮮滅菌乳中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。吸取初次培養(yǎng)液加入到新鮮滅菌乳，重復培養(yǎng)，至乳酸菌活菌總數濃度約為107～108CFU/mL，作為母發(fā)酵劑備用。

(5) 接種：殺菌復合果蔬中接種8%的Kefir母發(fā)酵劑。

(6) 保溫發(fā)酵：發(fā)酵溫度31 ℃。

(7) 調配：將發(fā)酵及未發(fā)酵復合果蔬的質量折算為凍干后干物質質量，向其中添加菊粉、低聚果糖和麥綠素，添加量分別為復合果蔬折算質量的13%，5%，3%[6-8]，攪拌均勻。

(8) 預凍、真空冷凍干燥：將物料倒入模具中，于-43 ℃預凍8 h后脫模、凍干。設定冷阱溫度-45 ℃、干燥倉內真空度10 Pa。

1.3.2 單因素試驗 以發(fā)酵時間、菌種接種量和發(fā)酵溫度為試驗因素，乳酸菌和酵母菌活菌數為考察指標，設計開菲爾菌發(fā)酵復合果蔬單因素試驗。

(1) 發(fā)酵時間的影響：固定開菲爾菌接種量8%，發(fā)酵溫度31 ℃，發(fā)酵時間分別為38，42，46，50，54 h，以確定最佳發(fā)酵時間。

(2) 菌種接種量的影響：固定發(fā)酵時間46 h，發(fā)酵溫度31 ℃，開菲爾菌接種量分別為4%，6%，8%，10%，12%，以確定最佳接種量。

(3) 發(fā)酵溫度的影響：固定發(fā)酵時間46 h，開菲爾菌接種量8%，發(fā)酵溫度25，28，31，34，37 ℃，以確定最佳發(fā)酵溫度。

1.3.3 響應面優(yōu)化 根據單因素試驗結果，以發(fā)酵時間、開菲爾菌接種量和發(fā)酵溫度為考察因素，乳酸菌活菌數和酵母菌活菌數為響應值，使用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken組合設計原理設計三因素三水平的響應面試驗[9]。

1.3.4 活菌數的測定 參照文獻[10]。

1.3.5 體外降糖試驗 果蔬復配后未經Kefir發(fā)酵，添加菊粉、低聚果糖、麥綠素再經真空冷凍干燥制成的產品即為未發(fā)酵固體飲品，以未發(fā)酵固體飲品為對照。將發(fā)酵及未發(fā)酵固體飲品制成不同濃度梯度稀釋液，參照馮雁波等[11]的方法測其α-淀粉酶抑制率。反應液3 000 r/min離心20 min后取上清液稀釋1 000倍，采用苯酚硫酸法[12]測定葡萄糖含量。葡萄糖回歸方程：y=0.139x-0.103 9，R2=0.990 2。

1.3.6 體外降脂試驗 將發(fā)酵及未發(fā)酵固體飲品制成不同濃度梯度稀釋液，參照包怡紅等[13]的方法測其膽酸鈉結合量。牛黃膽酸鈉的回歸方程為：y=0.09x-0.139 8，R2=0.969 9。

1.3.7 抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)清除率的測定：參照文獻[14]。

(2) 鐵還原力的測定：參照文獻[15]。

1.4 數據分析與處理

采用Microsoft Excel軟件進行數據處理，用Origin 9.1軟件作圖，響應面試驗設計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

如圖1所示，最佳發(fā)酵時間為46 h，最佳菌種接種量為8%，最佳發(fā)酵溫度為31 ℃。

2.2 發(fā)酵條件響應面優(yōu)化

2.2.1 因素水平和編碼設計 根據單因素試驗結果確定的因素水平表見表1。

2.2.2 響應面試驗設計與結果 Box-Behnken試驗設計及結果如表2所示。

圖1 各因素對發(fā)酵過程中活菌數的影響Figure 1 Effect of factors on viable bacteria during fermentation

表1 響應面試驗因素及水平

Table 1 Factors and levels of independent variables used for response surface analysis

水平A發(fā)酵時間/hB菌種接種量/%C發(fā)酵溫度/℃-1426280468311501034

2.2.3 回歸方程及參數分析 由軟件可得各因素對樣品乳酸菌活菌數(Y1)和酵母菌活菌數(Y2)的二次回歸方程分別為：

(1)

(2)

由表3可知，兩模型極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著，相關系數R2分別為0.998 5和0.999 2，說明模型擬合性較好，試驗誤差小，模型成立。3個因素對乳酸菌活菌數影響的主次順序為C>A>B，對酵母菌活菌數影響的主次順序為A>C>B；A2、B2、C2對乳酸菌活菌數有極顯著影響(P<0.01)，A和C對乳酸菌活菌數有顯著影響(P<0.05)；A、A2、B2、C2對酵母菌活菌數有極顯著影響(P<0.01)，C和BC對酵母菌活菌數有顯著影響(P<0.05)。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental designs and results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析?Table 3 Analysis of variance of regression model

? *. P<0.05，差異顯著；**. P<0.01，差異極顯著。

2.2.4 響應面優(yōu)化及分析

(1) 三因素交互作用對活菌數的影響：如圖2所示，發(fā)酵時間延長、溫度升高，復合果蔬的乳酸菌、酵母菌活菌數先增大后減少；發(fā)酵時間延長，乳酸菌、酵母菌活菌數曲面坡度較大，說明樣品活菌數受發(fā)酵時間影響顯著；溫度升高，乳酸菌活菌數先增多后減少，酵母菌活菌數先增多后急劇減少。接種量增加，開菲爾菌在發(fā)酵前期迅速產酸，發(fā)酵后期酸性物質積累過多，過酸環(huán)境不利于菌體生長[16]，致使活菌數隨發(fā)酵時間的延長而減少。發(fā)酵溫度升高，菌體活躍，但隨著時間的延長，溫度過高，開菲爾中的乳酸菌成為優(yōu)勢菌，而酵母菌細胞失活，提前衰老或死亡，所以產品中酵母菌活菌數大量減少[17]。

圖2 三因素交互作用對開菲爾發(fā)酵復合果蔬活菌數的影響Figure 2 Surface response plots showing the effect of three factors on viable count

2.2.5 最佳發(fā)酵工藝的確定 由軟件分析得到最佳發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時間46.44 h、接種量8.01%、發(fā)酵溫度30.81 ℃?？紤]到可操作性，將最佳工藝調整為發(fā)酵時間46.4 h、接種量8.0%、發(fā)酵溫度31 ℃，進行3次平行驗證實驗，測得發(fā)酵果蔬的乳酸菌活菌數7.58×1011CFU/mL，酵母菌活菌數7.41×1011CFU/mL。

2.3 體外功能評價結果

2.3.1 凍干后活菌數測定 測得凍干后產品乳酸菌、酵母菌活菌數分別為6.29×1011，6.22×1011CFU/g，乳酸菌、酵母菌活菌數存活率分別為83.0%和83.9%。

2.3.2 體外降糖試驗 如圖3所示，發(fā)酵及未發(fā)酵的凍干產品對α-淀粉酶都有抑制作用，且對α-淀粉酶抑制能力隨樣品濃度增加而增強，樣品濃度為1，2，3，4，5 g/L時，發(fā)酵組α-淀粉酶抑制率比未發(fā)酵組高27.97%，17.87%，13.22%，15.18%，31.05%，發(fā)酵后復合果蔬凍干制品的降糖效用優(yōu)于未發(fā)酵產品。未發(fā)酵及發(fā)酵樣品IC50值分別為5.15，3.88 g/L，說明發(fā)酵樣品對α-淀粉酶抑制效果優(yōu)于未發(fā)酵樣品。

圖3 發(fā)酵及未發(fā)酵樣品對α-淀粉酶抑制率的影響

Figure 3 The effect of fermented and unfermented samples on the inhibitory activity forα-amylase

2.3.3 體外降脂試驗 由圖4可知，發(fā)酵及未發(fā)酵樣品結合牛黃膽酸鈉作用均隨濃度的增大而增強，樣品濃度為1，2，3，4，5 g/L時，發(fā)酵組牛黃膽酸鈉結合量比未發(fā)酵組高59.37%，26.37%，61.54%，60.83%，67.79%，存在極顯著差異(P<0.01)。

2.3.4 體外抗氧化試驗 由圖5～7可知，復合果蔬凍干制品有較強的抗氧化性，樣品濃度為1，2，3，4，5 g/L時，發(fā)酵組DPPH·清除率比未發(fā)酵組高7.45%，0.23%，1.82%，28.19%，13.41%，發(fā)酵組·OH清除率比未發(fā)酵組高2.53%，6.74%，11.11%，12.30%，19.36%，發(fā)酵組還原力比未發(fā)酵組高10.78%，53.90%，21.01%，32.56%，25.70%，其中，發(fā)酵組·OH清除率極顯著高于未發(fā)酵組(P<0.01)。未發(fā)酵樣品清除DPPH·、·OH和還原力IC50值分別為2.15，-0.70，7.58 g/L，發(fā)酵樣品清除DPPH·、·OH和還原力IC50值分別為1.91，-0.11，5.80 g/L，說明發(fā)酵組抗氧化性優(yōu)于未發(fā)酵組。

圖4 發(fā)酵及未發(fā)酵樣品對牛黃膽酸鈉結合量的影響

Figure 4 The effect of fermented and unfermented samples on the binding amount of sodium taurocholate

圖5 不同濃度樣品對DPPH·的清除率

Figure 5 DPPH· removal rate of samples with different concentrations

圖6 不同濃度樣品對·OH的清除率

Figure 6 ·OH removal rate of samples with different concentrations

圖7 不同濃度樣品的還原力

Figure 7 The reducing ability of samples with different concentrations

3 結論

試驗將開菲爾接入復合果蔬漿中進行發(fā)酵，再添加一定量的菊粉、低聚果糖和麥綠素，經真空冷凍干燥制成一款休閑健康的固體飲品。試驗結果表明，開菲爾發(fā)酵復合果蔬最佳參數為發(fā)酵時間46.4 h、接種量8.0%、發(fā)酵溫度31 ℃；發(fā)酵組凍干產品降糖、降脂和抗氧化性均優(yōu)于未發(fā)酵組，說明開菲爾發(fā)酵使得整個體系降糖、降脂和抗氧化活性得到了提高。試驗著重探索了蘋果漿、番茄醬和沙棘原汁發(fā)酵工藝和凍干產品體外功能研究，并未對凍干產品進行感官評價，另外，發(fā)酵處理復合果蔬后添加菊粉、低聚果糖和麥綠素再經凍干可能有利于改善腸道菌群，但仍需通過動物試驗進一步研究[18]。