雷佳蕾，田丹，薛佳，2，3,4，鄧紅，3，4*，孟永宏，3，4，郭玉蓉，3，4

1(陜西師范大學(xué)，食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119) 2(農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，上海，200240) 3(國家蘋果加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，陜西 西安，710119) 4(西部果品資源高值利用教育部工程研究中心，陜西 西安，710119)

中國的蘋果產(chǎn)量居世界首位，蘋果汁是其重要的加工制品之一，按照工藝不同可分為濃縮還原汁和非濃縮還原汁(包括鮮榨汁)兩大類[1]。鮮榨蘋果汁(fresh apple juice，F(xiàn)AJ)是由新鮮蘋果直接壓榨后滅菌制成的果汁，因其果汁口感還有營養(yǎng)價值接近鮮果而成為一種健康飲品和消費趨勢，有巨大的市場需求和高昂的售價[2]。

目前，全球每年消耗超過1 600萬t的果汁，鮮榨蘋果汁的優(yōu)勢使它成為摻假的目標(biāo)，市場中存在用濃縮汁加水復(fù)原(from concentrate，F(xiàn)C)代替鮮榨蘋果汁或是在鮮榨蘋果汁中摻入FC果汁進(jìn)行銷售的現(xiàn)象[3]，因此，鮮榨蘋果汁的真實性一直是政府機(jī)構(gòu)關(guān)注的問題。同時消費者對食品的安全性和真實性的要求越來越高，為了確保公平的市場競爭并促進(jìn)國際貿(mào)易，保障消費者的利益，急需開發(fā)一種能夠檢測鮮榨蘋果汁真實性的技術(shù)。

但蘋果汁真空濃縮過程中化學(xué)成分變化不大，傳統(tǒng)物理和化學(xué)分析方法以及果汁的糖度、酸度、可溶性固形物、pH值等指標(biāo)的對比也不能夠輕易地區(qū)分鮮榨蘋果汁與濃縮復(fù)原汁[4]。而近10年來穩(wěn)定同位素技術(shù)已發(fā)展成為解決食品摻假問題的一個強(qiáng)有力的手段[5]，某些同位素分析方法已經(jīng)獲得了美國分析化學(xué)師協(xié)會(Association of Official Agricultural Chemists, AOAC)及歐盟標(biāo)準(zhǔn)化委員會(Comité Européen de Normalisation, CEN)的認(rèn)可(如ENV 12141 和 ENV 12142)[6-7]。同位素(isotope)指的是具有相同質(zhì)子數(shù)和不同中子數(shù)的一類元素的總稱，可以分為穩(wěn)定性同位素和放射性同位素。穩(wěn)定同位素分析法是一種對摻假果汁進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒別的有效方法，鑒別果汁真實性經(jīng)常用到的同位素是碳同位素、氫同位素和氧同位素[8-9]。許多研究[10-12]發(fā)現(xiàn)，果汁經(jīng)過水分蒸發(fā)達(dá)到濃縮的目的，并會富集δD 和δ18O，在濃縮汁中加水還原后制成的果汁中δD 和δ18O 低于原來的果汁，并且這種果汁中δD 和δ18O與加水量呈負(fù)相關(guān)性關(guān)系；因此可以運用穩(wěn)定氫氧同位素鑒別鮮榨蘋果汁與濃縮復(fù)原果汁。此外δ13C值的應(yīng)用研究表明[13-15]，不同來源的多種糖組分其δ13C 值有一定的范圍，且碳同位素比值不同，差值在 1‰以上就屬于明顯差別，所以利用δ13C 值可以判別鮮榨蘋果汁中外源糖摻假的問題。

目前穩(wěn)定同位素比率分析在我國食品科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，但在蘋果鮮榨汁鑒偽上應(yīng)用較少，除了牛麗影等[4]的研究還沒有其他報道。本文以多個品種蘋果為原料，在制備鮮榨汁、濃縮汁和摻假蘋果汁的基礎(chǔ)上，采用同位素比率質(zhì)譜法(isotope ratio mass spectrometry，IRMS)對不同品種蘋果鮮榨汁和摻假蘋果汁的δD、δ18O、δ13C值進(jìn)行了分析，通過同時使用水的δD，δ18O和外源糖中的δ13C來識別鮮榨蘋果汁的摻假問題。本研究旨在建立一種通過IRMS識別鮮榨蘋果汁的快速方法，從而為鮮榨蘋果汁的可追溯性和真實性提供解決方案，對促進(jìn)我國果汁出口也具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 原材料與試劑

不同品種的蘋果(表1),中國陜西白水現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新研究所；匯源蘋果汁、榮士蘋果汁,華潤萬家超市;其他果糖、葡萄糖和二糖、寡糖等均為分析純，西安晶博生物科技有限公司。水取自西安長安區(qū)的自來水，經(jīng)處理后符合國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5749-2006 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn))。標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水(standard mean ocean water，SMOW)的同位素豐度比值為 D/H=(155.76±0.10)×10-6；δ18O/δ16O=(2 005.20±0.43)×10-6。

表1 試驗研究用蘋果品種Table 1 Apple cultivars used in this study

1.2 儀器設(shè)備

WF-A2000榨汁機(jī)，浙江永康市偉豐電器廠；SC-3610高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；微蒸餾裝置，實驗室自行安裝[4]；DLT-100 LGR液態(tài)水同位素分析儀，美國Los Gatos Research公司；HPLC-co-IRMS高效液相色譜儀、同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 FAJ的制備

每個品種取3～4個新鮮蘋果來制備FAJ。將清洗、去核的蘋果投入家用榨汁機(jī)中榨汁，然后將其灌裝入25 mL具塞試管中，在90 ℃下滅菌1 min，將果汁樣品在-20 ℃下冷凍保存，進(jìn)行同位素分析時于室溫下解凍使用。

1.3.2 摻假蘋果汁(adulterated apple juice，AAJ)的制備

市售摻假果汁常用的方法是在果汁中添加水、糖和酸來冒充，為進(jìn)行對比分析，實驗制備了2種摻假果汁。第1種是添加外源水的摻假果汁，即將鮮榨蘋果汁在65 ℃下真空濃縮至70 °Brix，然后加水將其稀釋至鮮榨蘋果汁的濃度(°Brix)，巴氏滅菌后制成FC蘋果汁。將FAJ和FC蘋果汁以體積比0∶10、2∶8、4∶6、6∶4和8∶2、10∶0的比例混合，制成摻假程度為100%、80%、60%、40%和20%、0%的摻假果汁，以檢查同位素方法的適用性并減少蘋果品種的影響，定量確定外源水百分比的δD值。第2種是添加的外源糖的摻假果汁，即將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%，0.5%和2.5%的蔗糖添加到鮮榨蘋果汁中并加水調(diào)節(jié)其濃度(°Brix)與鮮榨蘋果汁相同，制成摻假果汁。

1.3.3 C、H和O同位素比(δ13C，δD和δ18O)的檢測分析

1.3.3.1 δD、δ18O的分析

自然界中重同位素與輕同位素的比值(分餾系數(shù))很小，所以對于水中的H、O同位素組成一般采用相對于 SMOW的千分差表示，當(dāng) δD 和 δ18O 為正值時， 表示樣品與SMOW相比富集了 D 和18O；當(dāng) δD 和 δ18O 為負(fù)值時，表明樣品中的2種同位素比SMOW標(biāo)準(zhǔn)中的虧缺。δD 和 δ18O 的測定分別按照 ENV 12141(1997)與 ENV 12142(1997)方法和相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]進(jìn)行。

微蒸餾法制備樣品：將 20 mL蘋果汁樣品放入50 mL蒸餾瓶中，并使用電加熱套加熱，溫度控制在120 ℃；來自蒸餾瓶的蒸汽通過冷凝器冷凝并收集在試管中，試管被放置在裝有少量液氮的保溫杯中。當(dāng)蒸餾瓶中蘋果汁的殘留量為2 mL時，停止加熱，取出試管并在-80 ℃的冰箱中快速密封保存，25 ℃解凍后用于進(jìn)樣分析。

同位素分析：δD和δ18O的測量是在液態(tài)水同位素分析儀進(jìn)行，該儀器是根據(jù)離軸積分腔輸出光譜原理設(shè)計以用于分析樣品中的同位素比。微蒸餾樣品通過0.45 μm過濾器過濾后進(jìn)樣分析。氫同位素比(D/H)以千分之一(‰)表示，18O/16O的測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為<0.2‰，D/H的測量誤差為<0.6‰。所有樣品均在相同的實驗條件下測量。通過相對于標(biāo)準(zhǔn)平均海水的千分之一(‰)計算出試驗樣品δD和δ18O的同位素比，如公式(1)所示，其準(zhǔn)確度分別為0.5‰和0.15‰[16]。

(1)

其中:R樣品,水樣品中D/H或18O/16O的比率;RSMOW,標(biāo)準(zhǔn)水樣品(SMOW)D/H或18O/16O的比率。

1.3.3.2 δ13C的分析

樣品準(zhǔn)備：5種鮮榨蘋果汁，3種摻有白砂糖的實驗室自制摻假蘋果汁，2種市售蘋果汁(commercial apple juice，CAJ)的樣品，將每個樣品稀釋30倍并過濾至2 mL小瓶中。

同位素分析[13,17]：δ13C的同位素分析在同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用的高效液相色譜儀(HPLC-co-IRMS)上進(jìn)行；色譜柱： Rezex RCM-Monosaccharide Ca2+(7.8 mm×300 mm)；柱溫80 ℃；流動相水；流速350 μL/min；氧化劑1.1 mol/L過二硫酸鈉溶液和0.3 mol/L H3PO4；流速50 μL/min；氧化反應(yīng)溫度99.9 ℃；進(jìn)樣體積9、25 μL，分別用于果糖、葡萄糖和二糖、寡糖、有機(jī)酸的測定計算。電子轟擊離子源(EI)：He壓力為400 kPa；CO2壓力為50 kPa；離子源電壓3.06 kV；真空度0.18 mPa。

通過Isolate 3.0軟件分析和計算樣品的δ13C值。δ13C值是根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Vienna pee dee belemnite standard(VPDB)計算得到，如公式(2)所示：

(2)

式中:R樣品為樣品的13C和12C同位素比，RVPDB=0.011 237 2；HPLC-co-IRMS的檢出限為0.7%。當(dāng)某物質(zhì)的百分比小于0.7%時，視為該物質(zhì)未檢出。

1.4 統(tǒng)計分析

所有樣品均重復(fù)3次，所有圖表均使用Graph Pad Prism 5完成，采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。表中的數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，且使用單因素方差分析分析圖中的數(shù)據(jù)，并使用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)<2%來分離均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同果汁中水的δD和δ18O值比較

2.1.1 FAJ和AAJ水中δ18O的特征

圖1-a表示不同品種蘋果汁水的δ18O值隨摻假度的變化。

a-不同品種蘋果汁中水的δ18O值隨摻假度的變化;b-不同品種FAJ和100% AAJ中水的δ18O值圖1 FAJ和AAJ中水的δ18O值的特征Fig.1 Characteristic of δ18O in the water of FAJ and AAJ注：**表示AAJ與FAJ相比差異極顯著(P<0.05)(下同)

圖1-b是不同品種蘋果的鮮蘋果汁和100%摻假蘋果汁中水的δ18O值。

生命體征（體溫、心率、呼吸、血壓）及實驗室檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖）的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗室相關(guān)的異轉(zhuǎn)率的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

由圖1可知，F(xiàn)AJ和AAJ之間的δ18O值存在明顯區(qū)別(P<0.05)，即摻假果汁的δ18O值均低于鮮榨果汁。FAJ中水的δ18O值在-4.54‰(JP)和-7.62‰(JG)之間，超過了西安當(dāng)?shù)厮摩?8O值(-11.09‰)。此外，試驗所用不同品種蘋果的FAJ中水的δ18O值都高于歐洲(羅馬尼亞蘋果)果汁[18]。分析認(rèn)為由于地理環(huán)境不同，影響了鮮榨蘋果汁的同位素比率[19]。圖1可以看出，隨著摻假程度的增高，δ18O值也依次降低，但AAJ的δ18O值隨摻假程度的變化規(guī)律需深入研究。

2.1.2 FAJ和AAJ中水的δD特征

外源水對δD值的影響見圖2。不同品種不同摻假程度蘋果汁中水的δD值變化見圖2-a，圖2-b是不同品種蘋果的FAJ和100% AAJ中水的δD值。

a-不同品種蘋果汁中水的δD值隨摻假程度的變化;b-不同品種FAJ和100% AAJ中水的δD值圖2 FAJ和AAJ中水的δD值的特征Fig.2 Characteristic of δD in the water of FAJ and AAJ

從圖2可知，所有FAJ中水的δD值均高于AAJ(P<0.05)，并且不同品種之間也存在差異。蘋果果實的δD通過蒸騰作用得以富集，其值高于地表水；但日照時間和降雨會影響不同蘋果品種的δD富集。由于氣候和地理環(huán)境的影響，不同品種蘋果的同位素值表現(xiàn)出一定的波動性，無法達(dá)到預(yù)期的效果。試驗得到的不同品種的δD值反映出FAJ和AAJ之間的一般特征，反映了果汁產(chǎn)品的“真實情況”，因為通常實驗室不是單從一個品種中獲取果汁來進(jìn)行市場控制，而是以最終生成的果汁樣品進(jìn)行分析。

由圖2可知，隨著摻假程度的不斷加深，δD值也發(fā)生變化。但是，大量AAJ樣品的δD值高于自來水(FAJ：-45.90‰～-59.00‰； AAJ：-50.70‰～-82.90‰；自來水：-65.52‰)，與預(yù)期結(jié)果不符。

分析檢測結(jié)果顯示δD值呈波動變化，所以用δ18O和δD值單一來判斷摻假程度存在一定難度，僅能判斷是否摻假，不能確定其摻假的量。所以需要在此基礎(chǔ)上對在不同摻假程度下δ18O與δD值的相關(guān)性進(jìn)一步探討。

2.1.3 果汁中水的δ18O與δD值的相關(guān)性

盡管在不同時間和空間獲得的水的同位素組成有很大變化，但δD和δ18O之間呈規(guī)律性變化，并且通常呈線性相關(guān)。CRAIG等[20]首次發(fā)現(xiàn)北美大氣降水的δD和δ18O組成呈線性關(guān)系，根據(jù)這些實驗數(shù)據(jù)，CRAIG將大氣降水線性方程擬合為公式(3)，即著名的克雷格全球降水線(Graig′s meteoric water line, global meteoricwater line of Graig, GMWL)。

(3)

克雷格大氣降水方程使用標(biāo)準(zhǔn)平均海水作為世界上大多數(shù)地區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)線，本試驗利用GMWL的特性來探討添加外源水的AAJ和FAJ中水的δD和δ18O關(guān)系，6組摻假果汁的分析結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同品種蘋果汁中水的δD與δ18O的線性關(guān)系Fig.3 Linear relationship of δ18O and δD between different juice from different cultivars of apple注：圖例為FAJ比例

由圖3可知，AAJ(0%FAJ含量、20%FAJ含量、40%FAJ含量)的價值點高于GMWL(線性方程：y=8x+10)[21]。不同摻假比例的點均勻分布在摻假程度為100%和0%的回歸線之間，并顯示規(guī)律性，從圖3可知，摻假率分別為100%、80%、60%、40%、20%、0%(FAJ)的AAJ具有統(tǒng)計學(xué)意義的氫氧同位素線性關(guān)系見表2。圖3說明摻假率不同的AAJ蘋果汁中水的δD和δ18O之間存在顯著相關(guān)性，且蘋果汁的δD和δ18O值均顯示出隨摻假程度的增加而降低的趨勢，當(dāng)外源水的添加量最大(即100%AAJ)，δD和δ18O值達(dá)到最低值。這與BONTEMPO等[22]和OGRINC等[23]的發(fā)現(xiàn)相似，δD和δ18O值在基于IRMS的外來水摻假認(rèn)證過程中起關(guān)鍵作用。

表2 不同果汁中水的δD與δ18O 值的方程擬合Table 2 Fitting of equations for δ18O and δD in FAJ

FAJ和100%AAJ的δD與δ18O 值分布范圍之間出現(xiàn)明顯的差異性(圖4)，進(jìn)一步說明了FAJ、AAJ(即FC蘋果汁)的氫氧同位素δ18O和δD具有顯著區(qū)別，能夠有效鑒別FAJ、AAJ。這與鐘其頂?shù)萚8]對橙汁的NFC與FC果汁的研究結(jié)果相似。

圖4 不同品種蘋果FAJ與100%AAJ中水的δD與δ18O分布Fig.4 Distribution of δD and δ18O in water of FAJ and 100% AAJ from different apple cultivars

2.2 不同果汁中糖類δ13C值比較

2.2.1 實驗室自制FAJ中糖類的δ13C特征

通過HPLC-IRMS測定實驗室自制5個蘋果品種的FAJ中果糖、葡萄糖和二糖、寡糖的δ13C值，并通過面積歸一法計算各成分的含量，其典型的LC-IRMS圖譜如圖5所示，結(jié)果見表3。

A-果糖；B-葡萄糖；C-二糖；D-寡糖(下同) 圖5 鮮榨蘋果汁FAJ中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.5 LC-IRMS chromatogram of saccharides in FAJ

從圖5可知，在相應(yīng)的保留時間671.37 s處(D)可以發(fā)現(xiàn)寡糖峰，而通過面積歸一化法計算的寡糖含量小于檢測限的0.7%。因此，認(rèn)為未檢測到寡糖。表3顯示了FAJ中果糖，葡萄糖和二糖的δ13C值范圍(果糖-25.64‰～-26.83‰，葡萄糖-25.01‰～-26.36‰，二糖-22.41‰～-23.24‰)，此外，分別計算出了果糖、葡萄糖和二糖的百分比范圍為48.84%～52.39%，14.34%～28.85%，10.47%～18.78%。，這意味著一旦蘋果汁中的δ13C值和各成分的含量百分比不在這些范圍內(nèi)，就可以認(rèn)為存在摻假。

表3 FAJ中果糖，葡萄糖和二糖各組分的δ13C值和占總糖百分比Table 3 δ13 C value and percentage of the fructose, glucose and disaccharide in FAJ

2.2.2 實驗室制備的AAJ中糖類的δ13C特征

為了驗證2.2.1實驗數(shù)據(jù)的可靠性，使用LC-IRMS確定實驗室自制的AAJ中的δ13C值和各成分的百分比，LC-IRMS圖譜如圖6所示，結(jié)果見表4。

從圖6可知，寡糖的相應(yīng)保留時間為670.42 s，但使用面積歸一化法計算出的寡糖含量也低于0.7%的檢出限，仍認(rèn)為寡糖未被檢測到。

圖6 摻假蘋果汁中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.6 LC-IRMS chromatogram of saccharides in AAJ

表4 AAJ中果糖，葡萄糖和二糖各組分的δ13C值和占總糖百分比Table 4 δ13C value and percentage of the fructose, glucose and disaccharide in AAJ

注： AAJ-1，AAJ-2，AAJ-3分別代表摻假蘋果汁中的外源糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、2.5%

從表4可知，外源糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、2.5%的AAJ中二糖的δ13C的值(-15.94‰～-21.26‰)和外源糖含量僅2.5%的AAJ中二糖成分百分比(23.19%)不在FAJ的范圍內(nèi)(表3)，這進(jìn)一步證實了該方法的可靠性。

2.2.3 市售蘋果汁(CAJ)中糖類的δ13C特征

為判別上述結(jié)論的正確性，從超市購買了不同品牌的商業(yè)蘋果汁飲料，然后檢測分析其δ13C值和各成分的含量，結(jié)果見圖7和表5。從表5可以看出，CAJ-1樣品中的果糖、葡萄糖和二糖δ13C值分別為-19.95‰、-15.66‰和-14.59‰、不在FAJ的δ13C范圍內(nèi)(表3)，在每種成分占總糖的百分比中，果糖僅為44.69%，葡萄糖為33.00%，綜上認(rèn)為不符合FAJ的特性。該市售果汁樣品是AAJ。CAJ-2樣品的果糖和葡萄糖δ13C值分別為-26.12%、-25.34%,其結(jié)果在FAJ范圍內(nèi)，可認(rèn)為該樣品是純蘋果汁。

圖7 商業(yè)蘋果汁中糖類的LC-IRMS色譜圖Fig.7 LC-IRMS chromatogram of saccharides in commercial apple juice

所以LC-IRMS可以快速地區(qū)分真正的鮮榨蘋果汁，可作為一種簡單有效的方法來鑒定鮮榨蘋果汁[24]。

因為鮮榨蘋果汁和產(chǎn)糖作物(例如玉米和甘蔗)的δ13C值之差是由于“ C3”或“ C4”型的不同代謝引起的[20]。δ13C與摻假程度的相關(guān)性部分符合ROSSMANN等[25]提出的內(nèi)部參考方法。試驗用LC-IRMS測定純鮮蘋果汁中果糖、葡萄糖和二糖的δ13C值，通過面積歸一化法計算各成分的百分比，然后通過實驗室用摻有白砂糖(C4型糖)的自制果汁進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)摻假果汁數(shù)據(jù)與純果汁數(shù)據(jù)之間存在一定的差異。LC-IRMS可以大大提高蘋果汁的鑒偽檢測水平，但對于果汁中特定摻假糖漿的類型，尚無深入研究，這將是后續(xù)工作的重點。

表5 商業(yè)蘋果汁(CAJ)中糖類的δ13C值和占總糖質(zhì)量百分比Table 5 δ13C value and percentage of sugar components in commercial apple juice (CAJ)

注：ND表示未檢出

3 結(jié)論

試驗研究表明，鮮榨蘋果汁中水的 δ18O 和 δD 值顯著高于摻假蘋果汁，摻假果汁中水的δD與δ18O值呈線性關(guān)系，且隨外源水含量增加而降低；鮮榨蘋果汁中糖分的δ13C值有比較確定的范圍和比例，且鮮榨與摻假蘋果汁的δ18O、 δD和法對所有大曲高光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行灰度共生矩陣參數(shù)δ13C值存在統(tǒng)計學(xué)差異。本研究所探討的δD，δ18O和δ13C同位素比鑒定鮮榨蘋果汁摻假程度的分析方法，克服了傳統(tǒng)鑒別方法不準(zhǔn)確、操作復(fù)雜的問題，值得建立數(shù)據(jù)庫進(jìn)行深入研究。