趙柄舒，王夢(mèng)竹，陳丹丹，沈弘洋，代偉長(zhǎng)，劉俊梅*

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春，130118) 2(吉林省食品生物制造科技創(chuàng)新中心，吉林 長(zhǎng)春，130118)

臭鱖魚是我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，以自然發(fā)酵的制作方式賦予臭鱖魚獨(dú)特風(fēng)味，深受人們喜愛(ài)。目前，臭鱖魚制作多以手工作坊加工為主，經(jīng)食鹽腌制后置于自然環(huán)境發(fā)酵而成[1-2]。臭鱖魚現(xiàn)有制作工藝受不同區(qū)域、腌漬方式及自然環(huán)境的影響，不同批次產(chǎn)品存在品質(zhì)差異大，風(fēng)味組成穩(wěn)定性差，安全性低等問(wèn)題[3-4]，這主要是由于發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的微生物菌群不可控，導(dǎo)致魚肉蛋白的降解程度有差異，直接影響風(fēng)味物質(zhì)組成。魚肉經(jīng)發(fā)酵過(guò)程中微生物酶作用降解為小分子肽、游離氨基酸等風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)是貢獻(xiàn)滋味的核心成分，其中游離氨基酸的含量和種類直接影響臭鱖魚的鮮味[5-6]。同時(shí)，臭鱖魚發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生腐敗致病菌及生物胺等有害物質(zhì)，是造成臭鱖魚制品安全品質(zhì)低的主要原因[3, 7]。文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)酵食品風(fēng)味組成較為復(fù)雜與其菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)[8-11]。為進(jìn)一步探究臭鱖魚中菌株與風(fēng)味間的相互作用，有學(xué)者采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法分離菌株，如楊培周等[12]在發(fā)酵8 d的臭鱖魚中分離出以蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌為主的微生物；李燕[7]對(duì)臭鱖魚發(fā)酵過(guò)程中微生物進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)菌群豐富多樣且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而遞減。臭鱖魚中的微生物菌株與發(fā)酵風(fēng)味的形成息息相關(guān)，經(jīng)菌株發(fā)酵后游離氨基酸的組成直接影響臭鱖魚的鮮味。同時(shí)，對(duì)分離菌株的特性進(jìn)一步探討，羅靚芷等[13]篩選并鑒定得到臭鱖魚中4株優(yōu)良乳酸菌，進(jìn)行了耐鹽性、發(fā)酵性和生長(zhǎng)特性研究。但針對(duì)產(chǎn)氨基酸風(fēng)味菌株篩選及加工特性評(píng)價(jià)的研究較少。本研究分離篩選自然發(fā)酵臭鱖魚中氨基酸產(chǎn)生菌，對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定并評(píng)價(jià)其加工特性，為進(jìn)一步提高臭鱖魚的安全品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離菌株的樣品來(lái)源

臭鱖魚，徽府源食品有限公司，冰藏(-10～-20 ℃)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室保藏待用。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

Si 60 F254薄層層析硅膠板，上海默克化工技術(shù)有限公司；L-天冬氨酸、L-谷氨酸等17種標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%),北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；茚三酮、異丙醇、甲酸等化學(xué)試劑(AR級(jí))，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基(MRS)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、LB肉湯培養(yǎng)基(LB)、無(wú)氮培養(yǎng)基(NCM)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

氨基酸對(duì)照液配制：準(zhǔn)確稱取0.001 gL-天冬氨酸、L-谷氨酸等17種標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL體積分?jǐn)?shù)10%異丙醇溶液，即得質(zhì)量濃度為1 g/L的氨基酸對(duì)照液。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液配制：準(zhǔn)確稱取亮氨酸23.4 mg，以體積分?jǐn)?shù)10%異丙醇溶解定容至50 mL，為標(biāo)準(zhǔn)液，將標(biāo)準(zhǔn)液50倍稀釋即為工作液(游離氨基氮量為1 μg/mL)。

水合茚三酮配制：準(zhǔn)確稱取0.6 g茚三酮，依次加入15 mL 正丙醇、30 mL 正丁醇、60 mL 乙二醇及9 mL pH 4.54的醋酸鹽緩沖液混勻，儲(chǔ)存在棕色瓶中，4 ℃保存。

質(zhì)量濃度1 g/L抗壞血酸配制：準(zhǔn)確稱取0.01 g抗壞血酸，加水溶解并定容至10 mL。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

TL-18M高速冷凍離心機(jī)，上海市離心機(jī)械研究所；Infinite M200 Pro NanoQuant酶標(biāo)儀，瑞士帝肯(Tecan)公司；2720 PCR擴(kuò)增儀，3730XL測(cè)序儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀，美國(guó)major science公司；Sub System 70電泳槽，美國(guó)Labnet公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離

無(wú)菌操作下，將少量臭鱖魚魚肉剪碎，準(zhǔn)確稱取25.0 g放置于225 mL無(wú)菌生理鹽水中搖勻。選取3個(gè)連續(xù)的稀釋梯度液，移取0.1 mL涂布于NB固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取形狀不同的單菌落，經(jīng)多次劃線純化，所得純菌株于NB斜面培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，置于4 ℃保藏[14]。

1.2.2 氨基酸產(chǎn)生菌株初篩

分離菌株傳代培養(yǎng)：采用無(wú)菌操作挑取斜面培養(yǎng)基上的菌落接種于NB液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，然后各菌株按照2%接菌量接種于NB液體培養(yǎng)基，完成2代培養(yǎng)。

將菌株活化后的菌液以2%接種量接種于NCM液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，重復(fù)上述操作傳代培養(yǎng)后菌液于9 000 r/min離心10 min，取菌株上清液待測(cè)[15]。采用薄層層析法(thin-layer chromatograph，TLC)對(duì)菌株上清液中氨基酸組成進(jìn)行定性分析。

1.2.3 氨基酸產(chǎn)生菌株復(fù)篩

將菌株活化后的菌液以接種量2%接種于NCM液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，傳代培養(yǎng)2次后菌液于9 000 r/min離心10 min，取菌株上清液待測(cè)[15]。采用茚三酮比色法對(duì)菌株上清液中游離氨基氮總量進(jìn)行定量分析。

測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行改良。取各菌株上清液1.0 mL分別加入一組具塞刻度試管中，加入無(wú)氨蒸餾水1.5 mL、3 mL水合茚三酮和0.1 mL抗壞血酸，密封試管口，于渦旋振蕩器混勻，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至20 mL，測(cè)定反應(yīng)后溶液的OD570 nm值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算游離氨基氮總量(μg/mL)，測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.4 16S rRNA序列分析鑒定菌株

將復(fù)篩獲得的菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，傳代2次后于12 000 r/min離心30 s，收集菌體。PCR擴(kuò)增引物：正向引物27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：1492 R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。引物的合成和PCR產(chǎn)物的測(cè)序委托上海桑尼生物科技有限公司完成。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min 30 s；35個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。將所得基因序列于NCBI BLAST系統(tǒng)中進(jìn)行比對(duì)，使用Clustal X和MEGA 7.0軟件采用Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，提交序列信息至GenBank獲取基因登錄號(hào)。

1.2.5 菌株耐鹽性試驗(yàn)

菌株耐鹽性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行改良。將獲得菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h，以1%的接種量分別接種至含4、6、8、10 g/100 mL NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，未添加NaCl的MRS液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，培養(yǎng)36 h后測(cè)定菌液OD600 nm值，測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.6 菌株氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[18-19]并進(jìn)行改良。將獲得的菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h，以1%接種量分別接種至含10 g/L精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸及酪氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中(含0.6 g/L溴甲酚紫作為指示劑)，不添加氨基酸的液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)3 d后，與對(duì)照相比，觀察氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基的顏色變化，判定菌株的脫羧酶活性。

1.2.7 菌株抑菌試驗(yàn)

通過(guò)牛津杯法[20]測(cè)定菌株抑菌活性。將獲得的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h后在9 000 r/min離心10 min，獲得上清液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。選擇沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichiacoli)作為指示菌株，依次接種至NB、MRS及LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃活化培養(yǎng)24 h，各取100 μL菌液于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上涂布，插入無(wú)菌牛津杯，注入200 μL菌株上清液，等體積注入空白MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)12 h后測(cè)量抑菌圈的直徑。試驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.8 氨基酸測(cè)定方法

1.2.8.1 氨基酸的定性測(cè)定

以質(zhì)量濃度1 g/L的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照，使用毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣間距1 cm，點(diǎn)樣量2 μL，點(diǎn)樣后用吹風(fēng)機(jī)吹干，展開劑：V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=40∶2∶10；顯色劑：5.0 g/L茚三酮。展開結(jié)束置于85 ℃干燥箱中顯色5 min。

1.2.8.2 氨基酸的定量測(cè)定

取1組具塞刻度試管，按表1依次加入試劑后密封試管口，于渦旋振蕩器混勻，在沸水浴中加熱15 min，冷卻后加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇定容至20 mL，測(cè)定溶液OD570 nm值，對(duì)應(yīng)亮氨酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪圖，MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸產(chǎn)生菌株的初篩

TLC常被用于氨基酸成分的定性分析，簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高[21-22]，可依據(jù)不同極性的物質(zhì)在層析板上展開條帶的差異進(jìn)行定性分析，展開劑的選擇對(duì)條帶展開效果的影響較大[23]。本研究采用V(異丙醇)∶V(甲酸)∶V(水)=40∶2∶10混合溶液作為展開劑，層析板上條帶顯色情況如圖1。

1-17依次表示：L-酪氨酸(Tyr)、L-甘氨酸(Gly)、L-色氨酸(Trp)、L-組氨酸(His)、L-脯氨酸(Pro)、L-甲硫氨酸(Met)、L-亮氨酸(Leu)、L-異亮氨酸(Ile)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-纈氨酸(Val)、L-丙氨酸(Ala)、L-蘇氨酸(Thr)、L-谷氨酸(Glu)、L-天冬氨酸(Asp)、L-絲氨酸(Ser)、L-賴氨酸(Lys)、L-精氨酸(Arg) 圖1 分離菌株上清液中氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition in isolated strains supernatant

除L-甘氨酸(Gly)外，16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品展開效果較好，條帶顯色清晰，說(shuō)明展開劑選擇適宜；菌株上清液中明顯展開1 ～ 3種氨基酸，說(shuō)明該展開劑能夠有效定性菌株上清液中氨基酸成分，其中E1-6、L2-2、S3-3、S3-8、E1-10和E2-4菌株上清液中呈現(xiàn)條帶個(gè)數(shù)≥2，表明這幾株菌的氨基酸組成更豐富。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及各菌株顯色條帶的比移值(retention factor value, Rf)如表2所示。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及分離菌株上清液中氨基酸的Rf值Table 2 Rf values of amino acid standards and amino acids of isolated strains supernatant

注：“-”表示菌株上清液中不含該種氨基酸

2.2 氨基酸產(chǎn)生菌株復(fù)篩

2.2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

依照1.2.8.2方法，測(cè)定不同濃度亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)液在反應(yīng)后的OD570 nm值，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.0532x+0.001 2，R2=0.996 4。

2.2.2 菌株上清液中游離氨基氮總量的測(cè)定

采用茚三酮比色法測(cè)定菌株上清液中的游離氨基氮總量，該方法成本低、重復(fù)性好[16, 24]，測(cè)得反應(yīng)后溶液的OD570 nm值，根據(jù)2.2.1中氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各菌株上清液中游離氨基氮總量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 分離菌株上清液中游離氨基氮含量Fig.2 Free amino nitrogen content in isolated strains supernatant注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

菌株L2-2上清液中氨基氮總量顯著高于其他菌株(P<0.05)；菌株E1-10和E1-12上清液中氨基氮總量次之(P<0.05)，均顯著高于其他菌株，這與TLC結(jié)果一致，說(shuō)明該方法雖不能明確區(qū)分菌株上清液中含有氨基酸的種類，但能夠快速準(zhǔn)確對(duì)其氨基酸成分進(jìn)行定量分析，有效提高了菌株篩選的效率[16, 24]。由此選擇菌株L2-2進(jìn)行下一步加工特性試驗(yàn)。

2.3 菌株16S rRNA序列鑒定

對(duì)菌株L2-2的基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的片段約1 500 bp，回收該菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上機(jī)測(cè)序，并獲得該菌株的序列文件。測(cè)序獲得菌株的序列通過(guò)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，提取相似度≥99%以上的相關(guān)比對(duì)序列及模式菌株序列，采用MEGA 7.0軟件中NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，菌株L2-2與清酒乳桿菌模式菌株(Lactobacillussakeisubsp.sakeistrain ATCC 15521 176)聚類在一起，與清酒乳桿菌(L.sakei)同源性達(dá)到99%。因此，菌株L2-2鑒定為清酒乳桿菌；在GenBank提交序列信息獲得基因登錄ID號(hào)MK592808.2。

圖3 L2-2菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 16S rRNA phylogenetic tree of L2-2 strain

2.4 菌株耐鹽性試驗(yàn)

傳統(tǒng)臭鱖魚制品的需鹽量通常為4%～5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，不同的鹽濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程中魚肉蛋白降解程度有差異，并影響其氨基酸風(fēng)味品質(zhì)[25]。為確保菌株在魚肉發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮作用，考察菌株的耐鹽性是評(píng)價(jià)其是否適應(yīng)加工工藝的指標(biāo)之一[26]。如圖4所示，菌株L2-2的生長(zhǎng)與NaCl質(zhì)量濃度成反比，與正常生長(zhǎng)菌株L2-2相比，NaCl質(zhì)量濃度為4～8 g/100 mL時(shí)，其生長(zhǎng)活力顯著降低(P<0.05)；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度大于8 g/100 mL，菌株L2-2生長(zhǎng)抑制趨于穩(wěn)定(P>0.05)。BEGANOVIC等[27]對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行4%～6% NaCl的耐鹽試驗(yàn)，指出優(yōu)良菌株的OD600 nm值在0.4～0.6之間。本研究中，菌株L2-2在質(zhì)量濃度為4 g/100 mL的NaCl下，生長(zhǎng)活力保持較好，OD600 nm為(0.64±0.05)，符合優(yōu)良耐鹽菌株的標(biāo)準(zhǔn)[27]，表明該菌株能夠適宜臭鱖魚加工需鹽量且維持較好活力。

圖4 菌株L2-2在不同NaCl濃度中的生長(zhǎng)活力Fig.4 The growth activity of L2-2 strain in different sodium chloride concentration

2.5 菌株氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

研究表明游離氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中易被微生物產(chǎn)生的特定脫羧酶脫羧形成生物胺，而氨基酸脫羧酶呈陰性的菌株則能夠大大降低發(fā)酵制品中生物胺的含量，提高產(chǎn)品的安全性[28]。為確保臭鱖魚制品的安全食用性，對(duì)菌株L2-2的氨基酸脫羧酶的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

如表3所示，菌株L2-2精氨酸脫羧酶呈陽(yáng)性，表明L2-2可能利用精氨酸脫羧產(chǎn)生鯡精胺，作為形成多胺的中間產(chǎn)物之一；其酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶活性均呈陰性，表明其水解酪氨酸，脫羧賴氨酸產(chǎn)生酪胺、尸胺及直接利用鳥氨酸，分解形成腐胺的可能性較低。由此看出，L2-2菌株通過(guò)自身產(chǎn)生氨基酸脫羧酶并形成生物胺的可能性較小。

表3 L2-2菌株的氨基酸脫羧酶活性Table 3 Amino acid decarboxylase activity of L2-2 strain

注：“+”表示反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性，“-”表示反應(yīng)結(jié)果呈陰性

2.6 菌株的抑菌試驗(yàn)

臭鱖魚的制作是經(jīng)自然環(huán)境發(fā)酵，存在產(chǎn)生腐敗致病菌的風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)價(jià)獲得菌株的抑菌特性是確保菌株安全應(yīng)用于臭鱖魚加工制作的重要指標(biāo)之一。菌株L2-2屬于乳酸菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一些細(xì)菌素能夠抑制腐敗菌及致病菌[29]。

挑選發(fā)酵食品中常用于抑菌試驗(yàn)的食源性致病菌，且能作為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的代表菌株[13]，分別為Salmonella、E.coli和S.aureus。由表4可知，菌株L2-2對(duì)E.coli及S.aureus具有一定抑制作用，抑菌圈直徑分別為8.13和7.58 mm，顯著高于其對(duì)Salmonella的抑制作用(P<0.05)。這與前人等[30-31]研究報(bào)道相一致，可以確保菌株L2-2在臭鱖魚發(fā)酵過(guò)程中使用的安全性。

表4 L2-2菌株的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of L2-2 strain

注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)從臭鱖魚中分離得到10株細(xì)菌，經(jīng)復(fù)篩得到1株產(chǎn)游離氨基氮總量最高的菌株L2-2，經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定為清酒乳桿菌，具有良好特性，能夠適應(yīng)傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚制品現(xiàn)有生產(chǎn)環(huán)境條件。此研究為傳統(tǒng)臭鱖魚制品風(fēng)味菌株的篩選，及解決自然發(fā)酵臭鱖魚制品安全性提供了理論依據(jù)。