張耀元，陳宏裕，王 華，王 林

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)的晚期，機(jī)體內(nèi)礦物質(zhì)代謝紊亂，繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，伴隨骨代謝異常，腎性骨病在顱頜面部的主要表現(xiàn)為頜骨纖維化畸形的顏面部外觀改變和牙周組織改變引起的咬合關(guān)系紊亂。顱頜面部較為嚴(yán)重的骨質(zhì)改變并發(fā)其他部位骨代謝異常，稱之為Sagliker綜合征[1]。近年來(lái)，該疾病發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化，并集中于女性，咬合關(guān)系紊亂引起咀嚼功能下降，嚴(yán)重頜面部畸形會(huì)影響其生活質(zhì)量，慢性腎臟病患者的口腔治療管理逐漸引起了口腔醫(yī)生的關(guān)注[2-3]。因此，探究慢性腎臟病繼發(fā)頜骨異常的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究對(duì)口腔治療有著重要意義。本研究建立腺嘌呤飲食誘導(dǎo)CKD小鼠模型，研究CKD小鼠的下頜骨微結(jié)構(gòu)變化，并從細(xì)胞學(xué)水平上探究正常對(duì)照組小鼠和CKD組小鼠的頜骨MSCs和股骨BMMs的生物學(xué)差異，為研究腎性骨病的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，7周齡，體質(zhì)量(21±1)g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地(SCXK(蘇)2016-0002)提供。在南京醫(yī)科大學(xué)五臺(tái)SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±2) °C，相對(duì)濕度60%，晝夜明暗交替(12 h)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)小鼠的純化加工飼料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司生產(chǎn)(蘇飼證(2014)01008)，在AIN-93飼料的基礎(chǔ)上調(diào)整比例，正常對(duì)照組飼料(1%鈣，0.6%磷)，CKD組飼料添加0.2%腺嘌呤(上海江萊生物)，均經(jīng)過(guò)Co60輻照滅菌[4]。小鼠全段甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)ELISA試劑盒(武漢優(yōu)生爾商貿(mào))、HE染色試劑盒(南京建成)、-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素溶液、胰酶(均購(gòu)自Gibco)、C57BL/6 MSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen)、Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo)、堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天)、茜素紅(Cyagen)、小鼠重組巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) (PeproTech)、小鼠重組核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL) (PeproTech)、抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(Sigma)。

1.3 主要儀器

生化分析儀(7100,日本日立)，酶標(biāo)分析儀(Molecular Devices,德國(guó))，小動(dòng)物高分辨率Micro-CT掃描儀(vivaCT 80,瑞士)，Skyscan分析軟件，模塊化組織包埋系統(tǒng)(HistoCore Arcadia)，全自動(dòng)半薄輪切片機(jī)(RM2265)、倒置熒光顯微鏡(DMI3000B)，正置熒光顯微鏡(DM4000B,均購(gòu)自德國(guó)徠卡)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腺嘌呤飲食誘導(dǎo)慢性腎臟病小鼠模型 20只七周齡C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組，每組10只。①正常對(duì)照組用正常飼料喂養(yǎng)12周；②CKD組用0.2%腺嘌呤飼料喂養(yǎng)8周，第9～12周喂養(yǎng)不含腺嘌呤正常飼料[5]。每隔4周行血清生化指標(biāo)檢測(cè)，通過(guò)眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血，靜置離心，分離血清，取上清液，-80 ℃保存待測(cè)。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)BUN、CREA、Ca、P水平[6]。第12周末，給予過(guò)量4%水合氯醛腹腔注射。小鼠處死后取其左側(cè)腎臟，縱向剖開(kāi)，將其固定在4%的多聚甲醛24 h，行脫水、包埋。5 μm厚度的腎臟組織切片HE染色觀察其基本病理變化[7]。

1.4.2 下頜牙槽骨Micro-CT掃描成像和HE染色分析 取小鼠單側(cè)下頜骨固定在4%多聚甲醛，24 h后Micro-CT對(duì)小鼠下頜骨進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)設(shè)定為：電壓55 kV，電流145 μA，分辨率15.6 μm。牙槽骨微結(jié)構(gòu)分析選取矢狀方向下頜骨第一磨牙根分叉區(qū)域?yàn)楦信d趣區(qū)域(region of interest，ROI)[8]。選取下頜骨冠狀方向測(cè)量下頜骨皮質(zhì)骨厚度[9]。使用Skyscan分析軟件對(duì)選定區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析，主要測(cè)量指標(biāo)有骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction, BV/TV, BVF)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、骨礦化密度(bone mineral density，BMD)和骨皮質(zhì)厚度 (cortical thickness)[10]。掃描后將小鼠右側(cè)下頜骨脫鈣，行脫水、包埋。5 μm厚度的骨組織切片行HE染色分析。

1.4.3 小鼠血清骨代謝指標(biāo)檢測(cè) 第12周末按ELISA試劑盒的步驟檢測(cè)血清PTH水平。

1.4.4 兩組小鼠頜骨MSCs的增殖和成骨能力比較 將小鼠4只/組麻藥過(guò)量致死，75%的乙醇浸泡15 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下將左側(cè)下頜骨分離，去凈軟組織和牙齒，PBS反復(fù)沖洗，并用眼科剪刀剪碎后，將骨片種在含有10%血清的-培養(yǎng)基25 cm2的培養(yǎng)瓶中，72 h后換液，以后每隔2～3 d換液，約15 d細(xì)胞可傳代培養(yǎng)[11]。CCK-8法檢測(cè)兩組小鼠頜骨MSCs的增殖能力，取兩組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代頜骨MSCs，以2×103個(gè)/孔密度接種于96孔板，每板每組10個(gè)孔。分別在1 d、3 d、5 d、7 d同一時(shí)間取出一板,加入10 μL CCK-8 和100 μL新鮮培養(yǎng)液,閉光孵育2 h后，酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度值(OD值)，繪制生長(zhǎng)曲線。兩組小鼠頜骨MSCs的成骨分化能力比較，取兩組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代頜骨MSCs，以1×104個(gè)/孔密度接種于24孔板,待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，更換成骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，3 d換液1次。誘導(dǎo)7 d后行堿性磷酸酶(ALP)染色。誘導(dǎo)21 d后，PBS輕輕漂洗后，4%多聚甲醛固定10 min，加入茜素紅染液染色3～5 min，倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照和觀察，并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析[12]。

1.4.5 兩組小鼠股骨骨髓BMMs破骨分化能力比較 無(wú)菌條件下取小鼠股骨的BMMs以5×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，在含有25 ng/mL的M-CSF和50 ng/mL的RANKL的破骨培養(yǎng)液中誘導(dǎo)7 d，行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色[13]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠慢性腎臟病模型的建立

正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)狀態(tài)正常，毛致密且有光澤；CKD組小鼠的體重下降，精神萎靡，毛量減少，脫毛，缺乏光澤，尿量增多。選取不同時(shí)間點(diǎn)行血清生化檢測(cè)，以判斷小鼠腎功能狀態(tài)。隨疾病進(jìn)程發(fā)展，與正常對(duì)照組對(duì)比，CKD組的血清BUN、CREA和P水平均升高，Ca水平輕度升高。第12周末時(shí)血BUN明顯升高，為(48.2±5.15)mmol/L，血清CREA升高為(64.5±8.49)μmol/L，血清Ca升高為(2.26±0.07)mmol/L、血清P升高為(3.55±0.88)mmol/L，圖1A。 腎臟組織病理結(jié)果顯示，光鏡下觀察CKD組腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，腎小球的數(shù)目減少，囊腔萎縮；腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，管腔見(jiàn)蛋白管型，腎間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)輕度纖維化，圖1B。由此可以判斷小鼠慢性腎臟病模型已經(jīng)成功建立。

2.2 小鼠下頜骨的形態(tài)學(xué)分析

Micro-CT三維重建后圖像顯示，造模12周末，正常對(duì)照組下頜骨未發(fā)生骨質(zhì)破壞；而CKD組下頜骨發(fā)生明顯骨質(zhì)破壞，下頜骨的髁突頸部、下頜角區(qū)域可見(jiàn)明顯的骨質(zhì)吸收,圖2A;小鼠下頜骨第一磨牙根分叉區(qū)域Micro-CT分析的感興趣區(qū)域,圖2B；CKD組的骨密度明顯降低，骨量減少，骨小梁厚度降低，骨小梁數(shù)量未發(fā)生明顯改變，骨小梁分離度明顯升高，骨指標(biāo)變化如表1；CKD組下頜骨的骨皮質(zhì)厚度降低，圖2C。小鼠下頜骨 HE染色結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，CKD組的第一磨牙根分叉區(qū)域的牙槽骨的骨量下降，板層狀骨減少，形成不規(guī)則的小梁骨，骨髓腔有較多的類骨質(zhì)形成，呈現(xiàn)骨質(zhì)纖維化的特征，圖2D。

A：血清指標(biāo)變化*：P<0.05,**：P<0.01,***：P<0.001,n=10);B：腎臟組織的HE染色

圖1腺嘌呤飲食誘導(dǎo)慢性腎臟病小鼠模型的建立

Fig.1Establishment of a mouse model of adenine-induced CKD

2.3 小鼠骨代謝指標(biāo)血清PTH檢測(cè)結(jié)果

造模12周末，CKD組小鼠血清骨代謝指標(biāo)PTH水平顯著高于正常對(duì)照組，如圖3。

A：下頜骨外觀; B：第一磨牙區(qū)根分叉區(qū)域定量分析感興趣區(qū)域(紅色); C：骨皮質(zhì)Micro-CT的定量分析; D：下頜骨HE染色

圖2兩組小鼠造模12周下頜骨Micro-CT分析和HE染色觀察

Fig.2Micro-CT analysis and HE staining observationof mandible in two groups at the end of the12th week

表1 兩組小鼠造模12周下頜骨第一磨牙區(qū)根分叉區(qū)的Micro-CT定量分析Tab.1 Comparison of microstructural parameters of alveolar bone in mandible of mice in two groups at the end of the 12th week n=10

***:P<0.001，n=10

圖3兩組小鼠血清PTH水平

Fig.3The levels of serum PTH in two groups

2.4 小鼠頜骨MSCs的增殖與成骨分化能力比較

CCK8檢測(cè)結(jié)果表明，CKD組小鼠頜骨MSCs增殖能力較正常對(duì)照組增強(qiáng)，3～7 d有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 圖4。對(duì)MSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)7 d后，CKD組的ALP陽(yáng)性區(qū)域高于正常對(duì)照組，半定量分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 如圖5A;成骨誘導(dǎo)21 d后，CKD組的茜素紅染色的礦化結(jié)節(jié)數(shù)目略低于正常對(duì)照組，半定量分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖5B。

*:P<0.05,n=10

圖4兩組小鼠頜骨的MSCs增殖曲線

Fig.4The growth curves of murine mandible-derivedMSCs in two groups

A： ALP染色及半定量分析( ×100); B： 茜素紅染色及半定量分析( ×100)；*：P<0.05,n=3

圖5兩組小鼠頜骨的MSCs的成骨分化能力比較

Fig.5Comparison of osteogenic differentiation capacity of murine mandible-derived MSCs in two groups

2.5 小鼠股骨BMMs破骨分化能力比較

股骨的骨髓BMMs經(jīng)過(guò)破骨誘導(dǎo)后，CKD組小鼠的多核破骨細(xì)胞顯著高于正常對(duì)照組,統(tǒng)計(jì)每組10個(gè)孔破骨細(xì)胞(細(xì)胞核>3)的數(shù)目平均值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，圖6。

***：P<0.001,n=10

圖6兩組小鼠股骨破骨細(xì)胞TRAP染色及半定量分析(×100)

Fig.6The TRAP staining and semi-quantitative analysis of osteoclast in two groups (×100)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用腺嘌呤飲食誘導(dǎo)小鼠CKD模型分析慢性腎臟病對(duì)頜骨微結(jié)構(gòu)的影響。腺嘌呤誘導(dǎo)CKD的原理是黃嘌呤脫氫酶作用于腺嘌呤將其氧化成2,8-二羥基腺嘌呤。2,8-二羥基腺嘌呤溶解度非常低，在腎小管中沉積為結(jié)石，導(dǎo)致廣泛的腎小管擴(kuò)張、壞死和纖維化，伴有腎功能障礙。與傳統(tǒng)的5/6腎切除手術(shù)相比，該造模方法的動(dòng)物生存率較高，并且傳統(tǒng)手術(shù)僅僅造成腎表面損傷，而對(duì)腎實(shí)質(zhì)功能影響有待考量，還有研究表明采用轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)造腎衰模型，由于其費(fèi)用較高，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物獲取上存在一定難度[5]。本實(shí)驗(yàn)采用含0.2%的腺嘌呤飼料飼養(yǎng)8周，每隔4周行血清生化監(jiān)測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)隨著疾病的進(jìn)展，CKD組小鼠的血清生化指標(biāo)如血清BUN、CREA、P顯著上升, 血清Ca輕度升高，反映小鼠腎功能逐漸下降，與既往研究結(jié)果一致。本研究在造模的第8周末更換成不含腺嘌呤飼料繼續(xù)飼養(yǎng)至第12周，有助于延長(zhǎng)小鼠壽命，可以更好地模擬慢性腎臟病并發(fā)骨病的長(zhǎng)期過(guò)程。

慢性腎臟病晚期繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到CKD組小鼠的血清PTH水平顯著增高。既往研究表明，PTH對(duì)骨代謝具有雙重影響，PTH可以導(dǎo)致成骨、破骨活動(dòng)增加，骨轉(zhuǎn)換率提高。高水平的PTH，以破骨細(xì)胞的骨吸收活動(dòng)為主，骨溶解后釋放鈣入血從而使鈣水平升高，同時(shí)導(dǎo)致骨質(zhì)破壞[14]，而且有研究表明PTH是下頜骨纖維化骨病的一個(gè)主要的驅(qū)動(dòng)因素[15]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CKD組小鼠下頜骨的骨密度降低，骨量減少，骨小梁厚度減少，骨皮質(zhì)厚度降低，這在一定程度上反映骨吸收活動(dòng)占主導(dǎo)，與既往臨床報(bào)道的證據(jù)[16-17]相一致。有臨床報(bào)道和研究觀察到CKD小鼠的下頜骨骨小梁數(shù)目增多，但是本實(shí)驗(yàn)中CKD組與正常對(duì)照組并無(wú)明顯差異，這種差異可能歸結(jié)于CKD疾病的階段，當(dāng)血清PTH水平升高初期，以成骨活動(dòng)為主導(dǎo)時(shí)，生成不規(guī)則不成熟骨小梁和類骨質(zhì)，從而導(dǎo)致骨小梁的短暫增加[18]。本實(shí)驗(yàn) HE染色進(jìn)一步觀察到CKD組小鼠下頜骨骨髓腔內(nèi)類骨質(zhì)增加，板層狀骨減少的特點(diǎn)。既往研究通過(guò)設(shè)置不同時(shí)間點(diǎn)觀察長(zhǎng)骨骨量的持續(xù)變化，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)骨的持續(xù)丟失，并在某個(gè)時(shí)間段骨皮質(zhì)分解迅速加快，同時(shí)PTH水平顯著升高，并推斷PTH的累積是皮質(zhì)骨分解代謝加速的原因之一[19]。

我們從細(xì)胞學(xué)水平對(duì)兩組小鼠的頜骨MSCs的生物學(xué)差異進(jìn)行探究。江建青等[20]從長(zhǎng)骨中提取的MSCs表現(xiàn)出高增殖和高成骨分化能力，本研究從CKD組小鼠的下頜骨提取的MSCs，其增殖能力增強(qiáng)，顯著高于正常對(duì)照組，7 d時(shí)ALP染色證明了早期成骨分化能力略強(qiáng)于正常對(duì)照組，但是茜素紅染色結(jié)果顯示，兩組MSCs誘導(dǎo)21 d后，CKD組形成礦化結(jié)節(jié)的能力略低于正常對(duì)照組。有研究表明，從臨床高轉(zhuǎn)化骨病患者骨片中誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞表現(xiàn)出高增殖能力和較低的礦化能力，但早期成骨標(biāo)志物的表達(dá)有所增加[21-22]。因此，我們推測(cè)在CKD組小鼠機(jī)體調(diào)節(jié)中，存在某些致病機(jī)制使成骨細(xì)胞后期表現(xiàn)一定程度的礦化異常。我們進(jìn)一步提取股骨BMMs，觀察其破骨分化能力。破骨細(xì)胞來(lái)源于骨髓單核巨噬細(xì)胞系的一種終末細(xì)胞[23]，相較于其他細(xì)胞而言，破骨細(xì)胞數(shù)量較少，從股骨骨髓干細(xì)胞中獲取BMMs誘導(dǎo)破骨細(xì)胞探究骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究較多[24]，細(xì)胞獲取方法較為成熟[25]，從小鼠頜骨提取破骨前體細(xì)胞的報(bào)道較少[26]，操作難度大，并基于既往報(bào)道長(zhǎng)骨的骨量丟失和本實(shí)驗(yàn)中頜骨的骨量丟失一致的表型，我們從股骨骨髓干細(xì)胞中獲取BMMs誘導(dǎo)破骨分化，證明了其破骨能力也顯著高于正常對(duì)照組。因此，基于本實(shí)驗(yàn)推斷CKD組小鼠頜骨內(nèi)高增殖的MSCs分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌大量因子，為破骨細(xì)胞的分化提供一定的基礎(chǔ)[27]。進(jìn)一步推斷這種高轉(zhuǎn)化機(jī)制可能致使骨量下降，骨密度降低，骨微結(jié)構(gòu)改變。

深入了解慢性腎臟病對(duì)頜骨代謝的影響及致病機(jī)制，對(duì)口腔醫(yī)生的臨床工作有著一定的指導(dǎo)意義。國(guó)內(nèi)臨床報(bào)道13歲女患兒上下頜骨隆起，下頜骨較為明顯的“河馬征”[28]，接診這類異常的頜骨畸形，需要仔細(xì)詢問(wèn)病史，警惕Sagliker綜合征。頜骨的骨量和骨密度，以及良好的牙槽骨對(duì)正畸牙齒移動(dòng)和正頜手術(shù)有著重要意義。伴有慢性腎臟病的患者，常規(guī)的外科拔牙術(shù)中，由于其骨質(zhì)密度的降低，及易發(fā)生頜骨的脆性骨折，影響創(chuàng)口愈合，所以在后期種植修復(fù)中，我們應(yīng)充分評(píng)估骨量和骨質(zhì)，在接診此類患者術(shù)中我們更應(yīng)做好保護(hù)工作。

綜上所述，慢性腎臟病繼發(fā)甲狀旁腺功能亢進(jìn)，PTH水平升高，機(jī)體內(nèi)礦物質(zhì)代謝紊亂，下頜骨的微結(jié)構(gòu)改變，骨量丟失，我們并對(duì)其從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)行初步探究。但本研究樣本量較小，將MSCs提取至體外，脫離了體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，其表型會(huì)發(fā)生一定程度改變，我們會(huì)進(jìn)一步增加不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的動(dòng)物進(jìn)行其成骨及破骨細(xì)胞的生物學(xué)研究，并繼續(xù)挖掘提取頜骨來(lái)源的破骨前體細(xì)胞最適宜的方法。CKD對(duì)頜骨代謝的影響需要大量深入研究，0.2%的腺嘌呤飲食可以成功誘導(dǎo)腎性骨病小鼠模型，為深入探究腎性骨病發(fā)生機(jī)制提供了較為理想的動(dòng)物模型。