馮治棋，左顯維，劉一丹，韓根亮，李工農(nóng)

(1. 甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所，蘭州 730000； 2. 甘肅省傳感器與傳感技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

0 引 言

功能化的磁性納米團(tuán)簇不僅具有大比表面積、高磁響應(yīng)和超順磁性的優(yōu)點(diǎn)[1-3]，還具備了和各種靶向抗體、多肽等生物分子偶聯(lián)的特點(diǎn)[4-6]。在生物分離、共振成像、靶向載藥、磁熱療、疾病的分子診斷、酶檢測、藥物篩選[7-10]等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。因?yàn)樗瑫r(shí)具備了富集和放大檢測信號的作用，因此可以有效捕獲待檢測生物分子，從而實(shí)現(xiàn)對生物分子的超靈敏識別，正成為特征生物信息高通量獲取的一種重要工具。目前通過配體鰲合金屬離子偶聯(lián)在磁性納米顆粒表面的方法主要應(yīng)用于蛋白的分離與純化領(lǐng)域[11-14]，在生物分子檢測領(lǐng)域少有涉及。因此制備高性能的磁性納米功能組裝體并將熒光信號富集在磁性納米功能組裝體的表面，通過熒光信號測量實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本中目標(biāo)物的檢測具有重要意義。

本文以Fe3O4為磁核，表面進(jìn)行SiO2包覆，通過羧基硅烷化試劑完成羧基化修飾，利用表面聯(lián)接的配體NTA鰲合金屬Ni2+，制備了一種高性能磁性納米功能組裝體(Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni)。將該組裝體與標(biāo)記熒光素的His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了富集與檢測,通過加入洗脫液，檢測上清液，解決了磁性納米功能組裝體自身熒光對生物分子檢測的干擾問題，提供了一個(gè)對生物分子靈敏檢測的新平臺。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 試劑

水合三氯化鐵，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；水合醋酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；乙二醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；濃氨水，天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純；正硅酸乙酯(TEOS)，上海中泰化學(xué)試劑有限公司，分析純；氯化鎳，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸鈉，45%的水溶液，Sigma-Aldrich；NA,NA-二(羧甲基)-L-賴氨酸水合物(NTA)，Sigma-Aldrich，分析純；N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，Sigma-Aldrich，分析純；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，Sigma-Aldrich，分析純；無水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.1.2 儀器

SCIENTZ-IID型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SCIENTZ-12N型冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BEXUS670型傅里葉變換紅外光譜(美國尼高力(Nicolet)公司)；IRIS-ER/S型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國TJA公司)；FS5型瞬態(tài)、穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)；NanoZSE型納米粒度及Zeta電位儀(英國馬爾文公司)；JEM-2010型透射電子顯微鏡(日本電子公司)；Inc8604型振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(美國LakeShore公司)；ZDJ-5B-D型自動滴定儀(上海雷磁)。

1.2 磁性納米功能組裝體制備

圖1為Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體的制備示意圖，具體步驟如下。

圖1 Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的制備Fig 1 The Formation of Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni

1.2.1 Fe3O4納米團(tuán)簇的制備

稱取0.34gFeCl3·6H2O，0.9gNaAc·3H2O溶于60 mL的乙二醇中，室溫?cái)嚢?，使固體完全溶解，得到混合溶液；將混合液加入100 mL聚四氟乙烯內(nèi)嵌的不銹鋼高溫反應(yīng)釜中，于180 ℃下反應(yīng)8h，冷卻后使用乙醇和去離子水各洗滌3次，外部磁場分離，冷凍干燥，得到Fe3O4納米團(tuán)簇。

1.2.2 Fe3O4@SiO2納米顆粒的制備

稱取0.025 gFe3O4納米團(tuán)簇(1.2.1)，加入12mL去離子水，20 mL乙醇，超聲10 min，在冰水浴的條件下，加入2 mL濃氨水，0.05 mL正硅酸乙酯，超聲40 min；外部磁分離，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥，得到Fe3O4@SiO2。

1.2.3 Fe3O4@SiO2@COOH磁性納米顆粒分散液的制備

稱取0.05g Fe3O4@SiO2(1.2.2)，置于100 mL三頸瓶中，加入40 mL乙醇，室溫機(jī)械攪拌，加入N-(三甲氧基硅基丙基)乙二胺三乙酸鈉1 mL，通氮?dú)獾臈l件下，于80℃下反應(yīng)8h；外部磁分離，去離子水清洗三次，得到Fe3O4@SiO2@COOH磁性納米顆粒的分散液。

1.2.4 Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性納米顆粒分散液的制備

取含0.03 g Fe3O4@SiO2@COOH磁性納米顆粒的分散液(1.2.3)，加入4 mL去離子水，加入40 mg EDC和40 mg NHS，混勻攪拌2 h，加入4 mg NA,NA-二(羧甲基)-L-賴氨酸水合物，室溫下反應(yīng)36 h；外部磁分離，加入4 mL去離子水，清洗3次，得到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性納米顆粒的分散液。

1.2.5 Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體分散液的制備

取Fe3O4@SiO2@COOH@NTA磁性納米顆粒的分散液(1.2.4)，外部磁分離后，分別加入4mL(0.1、0.5、1M)NiCl2水溶液，混合反應(yīng)2h；外部磁分離，加入去離子水，清洗3次，最后分散于0.3 mL去離子水中。

1.3 蛋白檢測

圖2為磁性納米功能組裝體提取與檢測的原理圖，取制備Fe3O4@SiO2@ COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體的分散液8.65 μL。加入一定量5 μM熒光標(biāo)記的具有His標(biāo)簽的蛋白，再加入PBS緩沖溶液，使總體積為600 μL，體系His標(biāo)簽的蛋白的濃度分別為(200、500、800 nM、1、2、3、4 μM)，反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，PBS緩沖溶液清洗3次，加入600 μL咪唑洗脫液(PBS，250mM咪唑，PH8.0)，反應(yīng)1 h，外部磁分離后，留上清液在激發(fā)波長490 nm、狹縫1 nm；發(fā)射波長520 nm、狹縫0.5 nm下進(jìn)行熒光檢測。

圖2 磁性納米功能組裝體檢測原理圖Fig 2 Detection schematic of magnetic nano-assembly structure

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM分析

圖3為(a)Fe3O4、(b)Fe3O4@SiO2、(c) Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni@蛋白的TEM照片。從圖1可得，(a) Fe3O4形貌是由極小的納米晶組成球形團(tuán)簇，粒徑約為200 nm且分散性良好；(b)是在圖(a) Fe3O4的基礎(chǔ)上包覆了一層SiO2，可以看到有明顯的包覆層，粒徑約為220nm且分散性良好；(c)是在(b)的基礎(chǔ)上經(jīng)過層層化學(xué)修飾，最終形成Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的磁性納米功能組裝體，并利用該組裝體與His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合得到的TEM圖。由圖可得，通過層層修飾后，粒徑增大到300 nm，且表面有凸起，表現(xiàn)出一定的粗糙度，初步證明其修飾成功，并且分散性良好。

圖3 (a)Fe3O4(b)Fe3O4@SiO2(c)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni@蛋白的TEM照片F(xiàn)ig 3 TEM image of Fe3O4, Fe3O4@SiO2 and Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni@Protein

2.2 紅外分析

圖4是Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni制備過程中，各中間體的傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜圖，其中d曲線是最終得到的磁性納米功能組裝體?？梢钥吹?90cm-1出現(xiàn)的峰是Fe-O鍵的伸縮振動峰[15]，是Fe3O4的特征峰，1084 cm-1處出現(xiàn)Si-O的反伸縮振動峰，795 cm-1處出現(xiàn)Si-O的對稱伸縮振動峰，955 cm-1處出現(xiàn)了Si-OH的彎曲振動峰，說明具有明顯SiO2的包覆層；3 378 cm-1附近出現(xiàn)的峰是O-H鍵的伸縮振動峰[16]。1 385 cm-1出現(xiàn)的峰對應(yīng)是C-N鍵的伸縮振動峰，這是由于NTA結(jié)構(gòu)中存在C-N鍵，1 624 cm-1處出現(xiàn)-COO-中C=O的伸縮振動峰且圖2(d)比圖2(c)的強(qiáng)度更強(qiáng)[17]，這是因?yàn)镹TA中帶有3個(gè)羧基，從而使其增強(qiáng)。以上數(shù)據(jù)從結(jié)構(gòu)上均表明磁性納米組裝體的成功制備。

圖4 (a)Fe3O4(b)Fe3O4@SiO2(c)Fe3O4@SiO2@COOH(d)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的傅里葉變換紅外(FT-IR)光圖譜Fig 4 FT-IR spectra of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2@COOH and Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni

2.3 Zeta電位分析

圖5是Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni制備過程中，各中間體的Zeta電位圖，從中可以看到(1)Fe3O4的Zeta電位是38mv，這是由于Fe3O4的制備過程中醋酸鈉不僅起到了反應(yīng)助劑的作用，同時(shí)NaAc中的羧酸基團(tuán)與顆粒表面優(yōu)先結(jié)合，而使在顆粒的外表面為帶正電荷的鈉離子[18]；(2)Fe3O4@SiO2的Zeta電位-31 mV，二氧化硅的零電荷點(diǎn)為pH=2.5，若pH<2.5則帶正電，反之，pH>2.5就帶負(fù)電；其依據(jù)在于SiO2在水中水解得到H2SiO3，然后硅酸電離，H+進(jìn)入到溶液中，剩下的HSiO3負(fù)離子附著在SiO2的表面，使得SiO2在水中顯負(fù)電性；(3)Fe3O4@SiO2@COOH的Zeta電位為-39 mV，羧基本身帶負(fù)電，SiO2表面羧基修飾后，負(fù)電性明顯增強(qiáng)；(4)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA的Zeta電位為-29 mV，相對于Fe3O4@SiO2@COOH的Zeta電位偏正，這是由于NTA結(jié)構(gòu)中N存在孤對電子所引起；(5)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的Zeta電位是-25 mV，由于引入了Ni2+，使其電位向正方向移動。

圖5 (1)Fe3O4(2)Fe3O4@SiO2(3)Fe3O4@SiO2@COOH(4)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA (5)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的Zeta電位圖Fig 5 Zeta potential of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2@COOH, Fe3O4@ SiO2@COOH@NTA and Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni in water

2.4 羧基密度測定

此外，我們也對羧基的含量進(jìn)行了計(jì)算：分別做出電導(dǎo)率下降和上升階段斜率a和b，再做一條平行于橫坐標(biāo)，經(jīng)過電導(dǎo)率最低點(diǎn)的直線c。它們相交所形成的AB線段在橫坐標(biāo)上對應(yīng)的體積就是NaOH消耗的體積V。

圖6 Fe3O4@SiO2@COOH電導(dǎo)滴定圖Fig 6 Conductometric titration curves of Fe3O4@SiO2@COOH

根據(jù)公式：-COOH=NV/m[19]，N表示滴定液NaOH的濃度，V表示消耗的體積，m表示所測試的羧基化磁性顆粒的質(zhì)量，計(jì)算得到Fe3O4@SiO2@COOH的羧基含量可達(dá)到0.5 μmol/mg。

2.5 氯化鎳濃度對Ni2+含量的影響

表1為不同氯化鎳濃度下，離子濃度對于NTA鰲合Ni2+含量的影響，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP)測定Ni2+含量。由表1可知，NTA對于Ni2+的鰲合量與加入氯化鎳溶液的濃度有極大的關(guān)系，1 g組裝體中Ni2+的最高鰲合量可達(dá)8.693×10-5mol。

表1不同NiCl2濃度下Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni中Ni2+的含量

Table1Ni2+ContentinFe3O4@SiO2@COOH@NTA-NiatdifferentconcentrationsofNiCl2

序號氯化鎳濃度1 g組裝體Ni2+含量1 g組裝體Ni2+含量10.1M1.294×10-3g2.19×10-5mol20.5M3.461×10-3g5.86×10-5mol31M5.129×10-3g8.693×10-5mol

2.6 磁性能測試

圖7是Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體及各中間體的磁滯回線，從圖中可知，F(xiàn)e3O4、Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2@COOH和Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的飽和磁化強(qiáng)度分別為：65、45、43和40 A·m2/kg。隨著非磁性物質(zhì)包覆的增加，飽和磁化強(qiáng)度逐漸降低，但由于團(tuán)簇的存在，通過層層包覆后磁化強(qiáng)度降低幅度并不明顯，依然具有較好的磁性。此外，不存在明顯的滯后環(huán)，幾乎無剩磁現(xiàn)象，表現(xiàn)出良好的超順磁性。這就保證了磁性納米功能組裝體在溶液中的快速磁分離。

圖7 (a)Fe3O4(b)Fe3O4@SiO2(c)Fe3O4@SiO2@COOH (d)Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni的磁滯回線圖Fig 7 Hysteresis loops of Fe3O4, Fe3O4@SiO2, Fe3O4@SiO2@COOH and Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni

2.7 Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體熒光檢測蛋白

圖8是磁性納米功能組裝體(前驅(qū)體)與His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗2次，分別測量得到的熒光光譜圖。從圖中可以看到，清洗一次(b)和清洗兩次(c)熒光強(qiáng)度幾乎不變，說明經(jīng)過兩次清洗后，前驅(qū)體表面已經(jīng)沒有非特異性吸附的His標(biāo)簽蛋白。同時(shí)，前驅(qū)體(a)和清洗一次(b)、清洗兩次(c)的熒光強(qiáng)度雖然有所變化，但是出峰位置都在516和600 nm，而我們設(shè)計(jì)的熒光素會在530 nm附近出現(xiàn)，所以猜測516和600 nm出現(xiàn)的是前驅(qū)體的峰，為了驗(yàn)證，我們做了對比實(shí)驗(yàn)，圖9是磁性納米功能組裝體(前驅(qū)體)與非His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗2次，分別測量得到的熒光光譜圖，與圖8相比，圖9出峰位置和熒光強(qiáng)度都沒有變化。因此，我們認(rèn)為前軀體本身激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光掩蔽了蛋白上熒光素激發(fā)產(chǎn)生的熒光，直接利用前驅(qū)體檢測熒光時(shí)會對檢測物產(chǎn)生干擾。鑒于此，我們利用洗脫液對目標(biāo)物進(jìn)行清洗，然后對清洗后的上清液進(jìn)行測量。

圖8 (a)前驅(qū)體，(b)前驅(qū)體與His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗1次，(c)前驅(qū)體與His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗2次的熒光光譜圖Fig 8 Fluorescence spectra picture of precursor, precursor reacted with histidine-tagged proteins after washed once and precursor reacted with histidine-tagged proteins after washed twice

圖10是前驅(qū)體與His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗所得上清液：(a)清洗1次，(b)清洗2次，(c)加入洗脫液。清洗一次后上清具有一定的熒光強(qiáng)度，且出峰位置在530 nm附近，經(jīng)過第二次清洗，上清液的熒光強(qiáng)度為零，加入洗脫液后上清液在530 nm出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的熒光峰。這是由于清洗多次以后，前驅(qū)體表面的非特異性吸附逐漸被清洗，使得上清液的熒光強(qiáng)度逐漸降低并最終將為零。而加入洗脫液后，上清液具有一定的熒光強(qiáng)度，是由于表面特異性吸附的蛋白被剝離進(jìn)入上清液。圖11是前驅(qū)體與非His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗所得上清液：(a)清洗1次，(b)清洗2次，(c)加入洗脫液。通過對比圖10發(fā)現(xiàn)清洗二次后上清液熒光強(qiáng)度均為零，而加入洗脫液后兩者有明顯的區(qū)別，圖10中c曲線在530 nm附近出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的熒光峰，而同時(shí)圖11中c曲線的熒光強(qiáng)度依然為零。這就說明我們制備的磁性納米功能組裝體實(shí)現(xiàn)了特異性連接His標(biāo)簽蛋白。

圖9 (a)前驅(qū)體，(b)前驅(qū)體與非His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗1次，(c)前驅(qū)體與非His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗2次的熒光光譜圖Fig 9 Fluorescence spectra picture of precursor, precursor reacted with no histidine-tagged proteins after washed once and precursor reacted with no histidine-tagged proteins after washed twice

圖10 前驅(qū)體與His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗所得上清液:(a)清洗1次，(b)清洗2次，(c)加入洗脫液的熒光光譜圖Fig 10 Fluorescence spectra picture of the supernatant obtained after precursor reacting with histidine-tagged proteins: (a) washed once, (b) washed twice, (c) add the eluent

圖11 前驅(qū)體與非His標(biāo)簽蛋白反應(yīng)后清洗所得上清液：(a)清洗1次，(b)清洗2次，(c)加入洗脫液的熒光光譜圖Fig 11 Fluorescence spectra picture of the supernatant obtained after precursor reacting with no histidine-tagged proteins: (a) washed once, (b) washed twice, (c) add the eluent

圖12 不同His標(biāo)簽蛋白濃度時(shí)上清液的熒光光譜圖Fig 12 Fluorescence spectra of supernate in the presence of different concentrations of histidine-tagged proteins

圖13 (a)2μMHis標(biāo)簽蛋白；(b)2μM His標(biāo)簽蛋白與組裝體反應(yīng)后上清液(c)咪唑脫液的熒光光譜圖Fig 13 Fluorescence spectra of 2μM histidine-tagged proteins, supernate obtained after precursor reacting with 2 μM histidine-tagged proteins and eluent containing imidazole

接著我們又研究了磁性納米功能組裝體與不同體系濃度His標(biāo)簽蛋白的反應(yīng)，經(jīng)過清洗，外部磁分離，加入洗脫液后取上清液測量。圖12為不同體系濃度下，上清液的熒光光譜圖，從圖中我們可以看到，隨著體系濃度的增加，上清液熒光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)達(dá)到2 μM時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最強(qiáng)，繼續(xù)增加濃度，發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度反而下降。說明當(dāng)體系濃度為2 μM時(shí)，該磁性納米功能組裝體的結(jié)合量最高，濃度過大即超過2 μM，會抑制該磁性功能組裝體與His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合。

此外，我們還做了一組對照實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步說明這種檢測新方法的可靠性。圖13是在2μM體系濃度下，純His標(biāo)簽蛋白、反應(yīng)后上清液及咪唑洗脫液的熒光光譜圖。首先咪唑洗脫液的熒光強(qiáng)度為零，對于熒光檢測沒有任何影響，反應(yīng)后的上清液熒光強(qiáng)度較純His標(biāo)簽蛋白有所降低，同時(shí)根據(jù)熒光強(qiáng)度，得到其反應(yīng)效率可達(dá)66.7%。

3 結(jié) 論

(1)利用改進(jìn)的溶劑熱法制備Fe3O4納米團(tuán)簇，以該團(tuán)簇為核，層層包覆制備得到Fe3O4@SiO2@COOH@NTA-Ni磁性納米功能組裝體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該功能組裝體擁有高的飽和磁化強(qiáng)度且保持超順磁性，在水相中具有良好的分散穩(wěn)定性，與His標(biāo)簽蛋白有很強(qiáng)的特異性結(jié)合能力。

(2)研究設(shè)計(jì)了一種新的檢測方法避免了磁性納米功能組裝體本身熒光對檢測結(jié)果的影響。通過各種實(shí)驗(yàn)證明利用洗脫后的上清液檢測目標(biāo)物的方法可靠性，并且咪唑洗脫液不影響熒光檢測，同時(shí)可以替換結(jié)合的His標(biāo)簽蛋白，保證了該磁性功能組裝體的多次重復(fù)利用。此外，類似的組裝體主要應(yīng)用于蛋白的分離與提取，而本研究提供了一種可以用于生物分子檢測的方法，拓展了其在生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。