王旭輝，董發(fā)勤，李瓊芳，潘 玲，宋 娜，于璐嘉

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010;2.西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，四川綿陽 621010;3.西南科技大學(xué)固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，四川綿陽 621010)

黃龍?zhí)幱诟吆貐^(qū)(平均海拔3 300 m，年平均溫度7℃)，其獨(dú)特的鈣華沉積方式引起了眾多研究者的興趣。與地質(zhì)上的礦化作用不同，黃龍鈣華的無機(jī)相結(jié)晶被生物體所分泌的有機(jī)質(zhì)嚴(yán)格控制。有機(jī)質(zhì)可以通過有機(jī)-無機(jī)界面的分子識別和協(xié)同作用(Sheng et al.，2003)選擇性地與無機(jī)相發(fā)生相互作用，從而對礦物的生長、取向、結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行調(diào)控(Dmitrovic et al.，2012)。礦化過程中，有機(jī)質(zhì)的預(yù)組織是生物礦化的模板前提，Oaki等(2012)利用有機(jī)酸誘導(dǎo)空心錐狀碳酸鹽晶體的預(yù)組織，氨基酸則能作為誘導(dǎo)CaCO3成核的有機(jī)模板(Hu et al.，2010)。當(dāng)一個有預(yù)組織的沉積環(huán)境形成時，CaCO3在有機(jī)-無機(jī)界面處成核并開始生長，其生長取向及速度受有機(jī)質(zhì)控制。Ping等(2018)利用具有有機(jī)質(zhì)特性的chisifica調(diào)控納米球霰石由中心向邊緣徑向生長，共聚羧酸則能使方解石生長速率降低92.7%(Chhim et al.，2017)。此外，在無外力作用下，CaCO3晶體一般會自主地由亞穩(wěn)定相轉(zhuǎn)化為熱力學(xué)最穩(wěn)定的方解石結(jié)構(gòu)，而通過改變有機(jī)質(zhì)含量能夠有效調(diào)控晶體結(jié)構(gòu)和形態(tài)。乙酸和天冬氨酸均能抑制球霰石向方解石轉(zhuǎn)化，通過改變天冬氨酸的濃度，能夠調(diào)節(jié)球霰石的形狀和大小(Tong et al.，2004;Li et al.，2018)。Yang等(2008)利用分子動力學(xué)模擬計算了幾種低聚糖在方解石晶面上吸附的寡糖單元(半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖等)含量，發(fā)現(xiàn)各糖類在不同晶面上被有選擇性地吸附，據(jù)此可以預(yù)測晶體的形貌。

黃龍水體中生物多樣性豐富(李瓊芳等，2015)。李騏言等(2013，2014)曾從中分離出2株具有高產(chǎn)碳酸酐酶(CA)活力的嗜冷型菌株，并從其胞外組分中發(fā)現(xiàn)了7種有機(jī)酸，其中琥珀酸和檸檬酸能夠抑制碳酸鈣的沉積。嗜冷型菌株分泌的碳酸酐酶能在一定程度上調(diào)控碳酸鈣的形貌(張文靜等，2016)，其分泌的核糖及半胱氨酸不僅能促進(jìn)碳酸鈣的沉積，還能誘導(dǎo)文石的產(chǎn)生(陳超等，2017;于璐嘉等，2018)。除了土著細(xì)菌，張存凱(2017)從黃龍水體中檢測出88種藻類，作為優(yōu)勢藻類，硅藻和黃藻既能為碳酸鈣的沉積提供模板，其分泌的有機(jī)質(zhì)對碳酸鈣的成核也具有誘導(dǎo)作用。目前的研究多集中于單一有機(jī)質(zhì)對無機(jī)礦物的調(diào)控方面，然而環(huán)境中的生物有機(jī)質(zhì)復(fù)雜多樣，其與無機(jī)離子之間的相互作用也非常復(fù)雜，單組分有機(jī)質(zhì)對鈣化過程的調(diào)控不足以完全揭示黃龍的生物礦化作用，多種有機(jī)質(zhì)對礦物相成核及生長的調(diào)控作用仍需深入挖掘。因此，本文依據(jù)黃龍水體中嗜冷細(xì)菌的胞外產(chǎn)物進(jìn)行室內(nèi)模擬研究，建立多種有機(jī)酸、氨基酸和單糖共存的混合體系，監(jiān)測其鈣化動力學(xué)過程，觀察產(chǎn)物形貌和結(jié)構(gòu)，探究參與礦化的主要組分，欲揭示混合體系中有機(jī)質(zhì)對碳酸鈣礦化過程的影響機(jī)理，這對于探究環(huán)境中的協(xié)同礦化作用具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 母液配制

試劑有 CaCl2、NaHCO3、檸檬酸、琥珀酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸、D-葡萄糖和 D-核糖等，均為分析純。

預(yù)先按照表1中的有機(jī)質(zhì)成分及濃度配制4種混合母液各1 L，依次命名為A-M、A-O、M-O和A-OM(A為氨基酸，M為單糖，O為有機(jī)酸)，再配制0.03 M CaCl2溶液和0.07 M NaHCO3溶液各1 L，備用。

表1 母液的成分及濃度 mMTable 1 Composition and concentration of solution

1.2 多組分體系的設(shè)置

體系溶液設(shè)置為60 mL，其中Ca2+和HCO-3的最終濃度參照黃龍水質(zhì)分析結(jié)果(李騏言，2014)分別設(shè)為8.25 mM和16.39 mM。整個反應(yīng)在靜置的培養(yǎng)瓶(300 mL)中進(jìn)行，將潔凈蓋玻片置于瓶底以收集沉積物，瓶口用封口膜密封，使用規(guī)格10 mL的注射器取樣。

實(shí)驗組:4種混合母液各取30 mL分裝至4個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶加入15 mL NaHCO3母液及15 mL CaCl2母液，分別命名為 A-M、A-O、M-O和A-O-M。

對照組:移取30 mL超純水至培養(yǎng)瓶，加入15 mL NaHCO3溶液和15 mL CaCl2溶液。

1.3 礦化動力學(xué)監(jiān)測

采用臺式數(shù)字酸度計(BANTE PHS-3CW)，分別于第1、3、5、7、9 d測試各體系 pH 值，并用注射器取5 mL樣品于離心管，抽濾后采用等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，ThermoFisher iCAP6500)檢測Ca2+的質(zhì)量濃度，波長范圍166～847 nm，CID檢測器，制冷溫度＜-40℃。通過指數(shù)衰減方程ρ(Ca2+)=ekt+b擬合數(shù)據(jù)擬合體系的沉積動力學(xué)過程，式中，ρ(Ca2+)為Ca2+的質(zhì)量濃度(mg/L)，t為時間(d)，k為鈣化速率常數(shù)，b為截距。d［ρ(Ca2+)］/dt用來計算鈣化速率(mg/d)。

1.4 沉積物相和形態(tài)的表征

沉淀物在80℃的烘箱里干燥至恒重，并研磨成粉末。通過X射線衍射儀(XRD，X Pert pro，PANalytical B.V.)表征沉積物的結(jié)構(gòu)特征，2θ角3°～80°，管電壓 40 kV，管電流 40 mA，掃描步寬 0.02°/min;使用Jade 6.0比對晶體物相;采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR，Spectrum One，PE)分析化學(xué)結(jié)構(gòu)，光譜范圍4 000 ～400 cm-1，信噪比100 000∶1，分辨率4 cm-1，DTGS檢測器;采用掃描電鏡(SEM，UItra55，Carl zeissNTSGmbH)觀察沉積物的形貌特征，加速電壓25 kV，探針電流200 pA。

2 結(jié)果與討論

2.1 CaCO3的動力學(xué)過程

實(shí)驗通過監(jiān)測Ca2+濃度和pH值來計算沉積速率，進(jìn)而比較各體系碳酸鈣的沉積情況。結(jié)果顯示，CaCO3沉積的動力學(xué)特征因各體系組分的差異而不同。如圖1a所示，各體系的Ca2+濃度在前3 d內(nèi)均隨時間急劇下降，后趨于平緩，但變化趨勢以及最終濃度存在差異。在A-M體系中，Ca2+濃度的下降趨勢最明顯，并始終低于其它體系，沉積速率較對照組提高了36%。M-O、A-O和A-O-M體系中Ca2+濃度變化趨勢略為平緩，最終濃度均高于對照組，鈣化速率較對照組分別降低了33%、29%、17%(圖1b)，說明氨基酸與多糖促進(jìn)了CaCO3的沉積，而有機(jī)酸則具有抑制作用。同時，由于在CaCO3的沉積過程中會消耗體系中的HCO-3使得體系溶液的pH值升高(圖1c)，相比于M-O、A-O和A-O-M體系，A-M體系pH值變化較快，由此也證明A-M體系沉積速率最快。

圖1 各體系中碳酸鈣的沉積動力學(xué)特征Fig.1 Sedimentary kinetics of CaCO3 in various systems during deposition

通過分析實(shí)驗結(jié)果，認(rèn)為A-M體系促進(jìn)CaCO3沉積主要有兩個原因:①羧基和羥基為CaCO3的沉積提供了成核位點(diǎn)(Cui et al.，2008);② 氨基酸的pI值與pH值不同時會帶上電荷，導(dǎo)致氨基酸與Ca2+和CO23-之間發(fā)生電荷吸引(陳昕等，2011)。酪氨酸(pI=5.68)、半胱氨酸(pI=5.05)、苯丙氨酸(pI=5.48)的等電點(diǎn)均低于體系pH值，氨基酸釋放質(zhì)子呈負(fù)電，與溶液中的正電荷離子相互吸引，在它們相互靠近的過程中，由于溶液中的氨基酸帶有大量的羧基，C=O的負(fù)電荷在向O移動時會形成強(qiáng)電場，電場對Ca2+具有強(qiáng)烈的吸引力(Jiang et al.，2017)，導(dǎo)致 Ca2+的聚集，形成局部過飽和的微環(huán)境，因此提高了成核速率(于福家等，2011)。此外，糖類添加劑所攜帶的大量—OH與Ca2+結(jié)合會降低成核活化能(馬潔等，2005)，能有效協(xié)同氨基酸進(jìn)一步促進(jìn)晶體成核。

相較于 A-M體系，M-O、A-O、A-O-M體系則抑制了CaCO3的沉積，分析原因可能是有機(jī)酸調(diào)控了鈣化過程。李騏言等(2013)認(rèn)為有機(jī)酸的加入會使體系形成酸性環(huán)境，從而抑制HCO-3的解離，因此Ca(HCO3)2則成為部分Ca2+的存在形式。此外，有機(jī)酸所攜帶的羧基在與Ca2+形成螯合物的同時，也降低了Ca2+的飽和度(張群等，2012)。由此可以認(rèn)為，有機(jī)酸對Ca2+的消耗導(dǎo)致了CaCO3沉積量的減少，同時也減緩了其沉積速率。

2.2 沉積物的結(jié)構(gòu)表征

通過XRD圖譜對實(shí)驗形成的沉淀產(chǎn)物的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除A-M體系外的各體系中形成的CaCO3均為方解石，晶體均以(104)晶面為主，表明多組分體系并不影響晶面的優(yōu)先生長(圖2a)。而A-M體系，除了方解石，在2θ為24.9°和27.0°處存在球霰石的衍射峰，分別對應(yīng)球霰石的(100)和(101)晶面(黃文藝等，2017;張曉蕾等，2018)，由Jade 6.0分析其含量僅為晶體總量的2.48%。紅外光譜圖中712、875及1 422 cm-1處的吸收峰分別對應(yīng)方解石CO2-3面內(nèi)彎曲振動、面外彎曲振動及非對稱伸縮振動(Park et al.，2015)(圖2b)。

圖2 CaCO3的X射線衍射圖譜及紅外吸收光譜Fig.2 XRD spectra and FT-IR spectra of CaCO3 in various systems

氨基酸和單糖均能誘導(dǎo)球霰石和文石的形成(Jackson and Bischoff，1971;Braissant et al.，2003;李磊等，2017)，A-M體系中存在少量的球霰石，說明該體系中存在能誘導(dǎo)球霰石形成的單組分有機(jī)質(zhì)，但M-O、A-O、A-O-M體系的XRD結(jié)果顯示，多種有機(jī)質(zhì)共同參與鈣化時僅形成了方解石一種晶體(圖2a)，這意味著有機(jī)酸抑制了球霰石的合成。此外，本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)了琥珀酸能夠誘導(dǎo)球霰石的生成(圖3)，排除了其對球霰石形成的抑制作用，因此可以推測為檸檬酸調(diào)控了CaCO3的晶型。Montanari等(2017)研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸與Ca2+的比例會影響CaCO3結(jié)晶，該比值越高，對球霰石的抑制作用越強(qiáng)，方解石的粒徑則越大，并且檸檬酸對文石生長的抑制作用相比于方解石更明顯(Gopi et al.，2015)。這與本文實(shí)驗結(jié)果相符合。

圖3 琥珀酸與檸檬酸分別作用下CaCO3的X射線衍射圖譜Fig.3 XRD spectra of CaCO3 under the action of succinic acid and citric acid

2.3 沉積物的形態(tài)表征

通過觀察掃描電鏡圖譜可以比較各體系對晶體形貌的調(diào)控效果。對照組合成了典型的菱面方解石(圖4a)。A-M體系合成了粒徑為5～10μm的菱面方解石，晶體發(fā)育不全，呈臺階狀，同時還存在中空環(huán)狀晶體，粒徑約5μm(圖4b)，結(jié)合XRD圖譜分析其為球霰石。球霰石含有兩個帶電荷的鈣平面，其電荷密度為6.7 Ca2+/nm2(Lippmann，1973)，帶負(fù)電荷的—COOH引起的強(qiáng)電場有利于與帶更強(qiáng)正電荷的晶面相互作用，從而引起結(jié)構(gòu)變化(Tong et al.，2004)。其中空環(huán)狀的形貌形成過程可能為:①分子間力(如氫鍵、疏水作用或靜電作用)重排分子，形成中空環(huán)狀結(jié)構(gòu)，親水端(—OH)朝外，疏水末端(C6H-5)朝內(nèi);② 環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成后，Ca2+通過靜電作用吸附在親水性末端，使晶粒沿著環(huán)形分子層的表面聚集，形成中空片狀晶體(Takahashi et al.，2004)。

M-O、A-O體系均合成長軸徑為5～15μm、短軸徑為3～5μm的棒狀晶體，晶體在基底表面平鋪一層，分散性好(圖4c、4d)。研究表明，檸檬酸能夠強(qiáng)烈抑制CaCO3晶體的生長(Karar et al.，2015)，其分子中的羧基可通過配位鍵與Ca2+形成螯合物(檸檬酸鈣)，吸附在固-液界面的Ca(OH)2表面，降低晶體的成核速率(伊昌等，2011)，導(dǎo)致M-O、A-O體系合成的晶體較少。其次，檸檬酸α-C上的羥基取代基會選擇性地吸附在晶體表面，不僅通過改變晶體表面的能量分布，誘導(dǎo)晶體沿c軸生長(林榮毅等，2002;Westin and Rasmuson，2005)，而且形成空間位阻，減弱了晶體之間的吸引力，導(dǎo)致M-O和A-O中的晶體不團(tuán)聚。

A-O-M體系中的晶體個數(shù)多、尺寸小(粒徑約為1～3μm)，且晶體聚集成簇狀(圖4e)。與M-O、A-O體系晶體生長方式不同，氨基酸協(xié)同單糖提高了A-O-M體系的過飽和度，有效克服了檸檬酸對晶體成核的抑制作用。經(jīng)典成核理論Gibbs-Thomson公式表明，保持溶液的過飽和微環(huán)境可以提高晶體的成核速率(Tong et al.，2004)。當(dāng)晶體的成核速率較高時，晶體的生長會相對受到抑制，有助于晶體的細(xì)化(Yang and Nan，2010)。A-O-M體系中有機(jī)質(zhì)含量最高，既能提供充足的成核位點(diǎn)，還能促進(jìn)過飽和微環(huán)境的形成，以致晶體成核速率被提高，用于晶體生長的離子相對變少，因此形成的晶體粒徑小。

圖4 CaCO3的掃描電鏡圖像Fig.4 The SEM images of CaCO3 in various systems

3 結(jié)論

本文通過實(shí)驗比較了多種有機(jī)質(zhì)共同作用下碳酸鈣的礦化現(xiàn)象，得到了以下結(jié)論:

(1)氨基酸協(xié)同單糖促進(jìn)了CaCO3的沉積，并延長了中空的環(huán)狀球霰石的穩(wěn)定時間;

(2)當(dāng)氨基酸或單糖單獨(dú)與有機(jī)酸混合參與礦化時，鈣化速率大幅度降低，晶體的結(jié)構(gòu)與形貌受檸檬酸強(qiáng)烈調(diào)控;

(3)增加有機(jī)質(zhì)含量能夠有效克服檸檬酸對晶體成核的抑制作用。