朱迪冰，趙海燕，何建丹，杜雨涵，王少兵

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074)

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃、郁金、莪術(shù)等根莖中提取出來的主要成分，是植物界天然的二酮類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等多種藥理活性，且不良反應(yīng)輕微，藥源充足，極具開發(fā)前景[1-2]。姜黃素可以治療阿爾茲海默病癥，它還可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞受體連接以及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號來控制肝腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生、增加和轉(zhuǎn)移，所以常用于肝癌等的治療[3]。而由于姜黃素本身的限制條件，水溶解度較低，不易進(jìn)入細(xì)胞，在體內(nèi)半衰期短，代謝快，生物利用度較低，穩(wěn)定性差，不利于藥物發(fā)揮作用[4]。因此研究影響姜黃素穩(wěn)定性對于姜黃素制劑的開發(fā)具有重要意義。

PLGA納米粒作為藥物載體，生物相容性好，具有良好的生物降解性，無刺激性，毒副作用小，經(jīng)酯鍵斷裂降解為乳酸和羥基乙酸，通過三羧酸循環(huán)被代謝為二氧化碳和水從體內(nèi)排出。PLGA納米粒在降解時(shí)，納米粒表面會(huì)逐漸產(chǎn)生微孔，使藥物暴露在納米粒表面逐漸溶解釋放，達(dá)到長效緩釋目的。納米粒具有靶向性，可以通過胞飲作用或者吞噬作用直接進(jìn)入細(xì)胞，因而可以避免細(xì)胞膜上的外排泵對藥物的外排作用，防止藥物被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬，從而提高療效[5]。

本研究通過單因素試驗(yàn)，采用PLGA為載體材料，PVA為乳化劑，以粒徑、包封率和載藥量為指標(biāo)篩選出姜黃素PLGA納米粒的最優(yōu)處方，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，為后續(xù)開發(fā)姜黃素的新制劑提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀(Agilent 1100型，美國Agilent公司)；高速離心機(jī)(TGL-16C，上海)；超聲波細(xì)胞破碎儀(JY96-IIN，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(III)，河南省予華儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(85-2，金壇市科興儀器廠)；傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET 6700型，美國Thermo Scientific)；X射線衍射儀(XRD，D8型，德國Bruker)。

材料：姜黃素(Cur)，PLGA(50∶50，分子量5.5萬，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇(88%水解度，上海威呈化工有限公司)；甲醇(色譜純，美國天地)；其余試劑均為市售分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸水(80∶20)，柱溫：25 ℃，流速：1.0 mL/min，檢測波長：450 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 PLGA納米粒制備

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備Cur-PLGA-NPs[6]，取20 mg PLGA溶于1 mL有機(jī)溶劑中，隨后將一定量藥物粉末溶于聚合物溶液中。所得的溶液逐滴加入2 mL 2% PVA水溶液中，冰浴中超聲20 min得到初乳。將初乳滴加到10 mL 0.5% PVA水溶液中，減壓蒸發(fā)1 h。5 000 rpm離心10 min除去大顆粒和析出的藥物，上清液在4 ℃、20 000 rpm離心30 min收集納米粒，再用適量蒸餾水洗滌2次，重新分散在少量蒸餾水中，冷凍干燥收集的納米粒，于低溫冷凍干燥機(jī)中干燥24 h，得到Cur-PLGA-NPs。

1.4 包封率和載藥量的測定

精密稱取5 mg Cur-PLGA-NPs，充分溶解于5 mL甲醇中，超聲20 min，通過0.22 μm微孔濾膜，HPLC法測納米粒中姜黃素含量。

包封率計(jì)算公式：EE%=實(shí)測載藥量/理論載藥量×100%

載藥量計(jì)算公式：DL%=納米粒中測得的藥物總量/納米?？傎|(zhì)量×100%

1.5 粒徑與粒徑分布

將Cur-PLGA-NPs重新分散在蒸餾水中配制成混懸液，置于動(dòng)態(tài)光散射儀樣品池中進(jìn)行測定。

1.6 性能表征

透射電鏡(TEM)：將Cur-PLGA-NPs凍干粉樣品分散在蒸餾水中稀釋成適當(dāng)濃度，將銅片浸泡在樣品溶液一段時(shí)間后自然干燥，TEM觀察并拍照。

X射線衍射(XRD)：取Cur、PLGA、Cur與PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉進(jìn)行XRD射線衍射分析，工作條件：Cu靶，石墨單色器衍射單色化，管電壓50 kV，管電流200 mA，掃描范圍2θ為5° ～80°[7]。

差示掃描量熱法(DSC)：將Cur、PLGA、Cur與PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉分別裝入鋁坩堝中，在靜態(tài)的空氣環(huán)境中測定，稱樣量約5 mg，升溫速度為10 ℃·min-1，溫度范圍為0～200 ℃。

紅外光譜(IR)：采用溴化鉀壓片法將Cur、PLGA、Cur和PLGA物理混合物、Cur-PLGA-NPs凍干粉分別制備成樣品后進(jìn)行紅外掃描分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法，保持其他條件不變，分別改變超聲時(shí)間，測定藥物的粒徑和載藥量。試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，當(dāng)超聲時(shí)間超過20 min時(shí)，粒徑和載藥量無明顯變化，因此選擇超聲時(shí)間為20 min。

表1 超聲時(shí)間對粒徑和載藥量的影響

2.1.2 有機(jī)溶劑對粒徑和載藥量的影響 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法，保持其他條件不變，改變有機(jī)溶劑丙酮與二氯甲烷比例，測定藥物的粒徑和載藥量，結(jié)果見表2。由表2可見，當(dāng)二氯甲烷混有丙酮時(shí)，粒徑明顯降低，但隨著丙酮含量的增高，粒徑無明顯影響，可能的原因是二氯甲烷為水性不溶性溶劑，當(dāng)含有載體材料的二氯甲烷滴入水中，會(huì)形成油滴，這些油滴僅能依靠機(jī)械攪拌作用分散在水中，故形成的納米粒粒徑較大，而對于水溶性的丙酮，當(dāng)含有聚合物的有機(jī)溶劑被滴入水相時(shí)，溶劑會(huì)立刻分散在水中，聚合物不易聚集在一起，故形成的納米粒粒徑較小[8]。

隨著丙酮含量的增加，載藥量降低，分析其原因可能是溶劑極性過高，藥物容易朝水中泄露，因此選擇丙酮∶二氯甲烷體積比為1∶4。

表2 有機(jī)溶劑對粒徑和載藥量的影響

2.1.3 Cur投藥量的考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法，保持其他條件不變，姜黃素投藥量分別為1 mg、1.5 mg、2 mg、4 mg時(shí)，納米粒的包封率和載藥量如圖1。由圖1可見，包封率隨著Cur的投藥量增加而降低，而載藥量增高，由于當(dāng)投入Cur為4 mg時(shí)，包封率大幅降低，因此選擇Cur投藥量為2 mg。

圖1 Cur與PLGA比例對包封率和載藥量的影響

2.1.4 初乳中PVA體積和濃度的考察 按照“1.3”項(xiàng)下制備方法，Cur 1.5 mg，PLGA 20 mg，其他條件不變，考察初乳中PVA濃度和體積對包封率和載藥量的影響。結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 PVA濃度對包封率和載藥量的影響(一)

圖3 PVA體積對包封率和載藥量的影響(二)

由圖2可知，當(dāng)PVA體積分別為1、2、3、4 mL時(shí)，包封率和載藥量均先增加后降低，可能的原因是當(dāng)水相和油相比例為1∶1時(shí)，不易形成水包油，當(dāng)水相比例過大，導(dǎo)致初乳穩(wěn)定性降低，藥物容易朝水相中泄露，因此選擇初乳水相體積為2 mL。

由圖3可知，當(dāng)PVA的濃度分別為1%、2%、4%時(shí)，包封率和載藥量都是先增加后降低，可能的原因是PVA是乳化劑，PVA濃度在一定范圍內(nèi)，對初乳的乳化效果會(huì)更好，因此可以裝載更多的藥物，但是當(dāng)PVA濃度繼續(xù)增大，包封率和載藥量開始下降，可能是因?yàn)楦邼舛萈VA溶液過于黏稠，導(dǎo)致藥物更容易擴(kuò)散進(jìn)入水相，因此選擇PVA濃度為2%。

2.2 最優(yōu)處方及三批重現(xiàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，篩選出最優(yōu)處方為Cur 2 mg，PLGA 20 mg，有機(jī)溶劑組成為丙酮∶二氯甲烷=1∶4，初乳中PVA體積2 mL，濃度2%，超聲時(shí)間20 min。在最優(yōu)處方下制備的3批Cur-PLGA-NPs包封率、載藥量和粒徑如表3所示。

表3 Cur-PLGA-NPs的包封率、載藥量和粒徑

2.3 CUR-PLGA-NPs的表征

2.3.1 透射電鏡法(TEM) Cur-PLGA-NPs的TEM圖像如圖4所示，納米粒微觀形態(tài)呈較規(guī)則的球形或類球型，均在納米尺寸范圍內(nèi)，表明圓整光滑。

圖4 Cur-PLGA-NPs的TEM圖像

2.3.2 紅外光譜分析(IR) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs凍干粉的IR圖譜如圖5。圖5顯示Cur在3 507.33 cm-1有-OH特征吸收峰，在1 629.65和1 598.78處有C=O特征吸收峰。PLGA在1 747 cm-1處有C=O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰。在包封的納米粒中，上述峰均存在，因此沒有新的化學(xué)鍵的形成。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

2.3.3 差示掃描量熱法(DSC) Cur、PLGA、物理混合物和Cur-PLGA-NPs的DSC圖譜見圖6。由圖6可見PLGA聚合物在50 ℃左右顯示出1個(gè)小峰，指的是玻璃化轉(zhuǎn)變后的弛豫峰，沒有觀察到明顯的熔點(diǎn)，因?yàn)镻LGA本質(zhì)上是無定形的。Cur在174.7 ℃產(chǎn)生對應(yīng)于結(jié)晶區(qū)熔點(diǎn)的尖峰，物理混合物也在此處出現(xiàn)了熔融吸熱峰，然而，在Cur-PLGA-NPs中未觀察到Cur的特征峰，這可能是由于Cur的結(jié)晶形式轉(zhuǎn)化為無定形形式[9]。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

2.3.4 X射線衍射(XRD) 為了進(jìn)一步了解Cur和PLGA聚合物之間的相互作用，使用X射線衍射(XRD)，結(jié)果如圖7。由圖7可知，Cur的晶體特征峰并未在Cur-PLGA-NPs中顯示。這一現(xiàn)象可能表示了Cur的晶體形式轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)形式，這與DSC的結(jié)果一致。

a)Cur；b)PLGA；c)physical mixtures；d)Cur-PLGA-NPs

3 結(jié)論

以PLGA為載體材料，PVA為乳化劑，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備了Cur-PLGA-NPs，以包封率、載藥量和粒徑篩選了最優(yōu)處方為：Cur 2 mg，PLGA 20 mg，有機(jī)溶劑組成為丙酮∶二氯甲烷=1∶4，初乳中PVA體積2 mL，濃度2%，超聲時(shí)間20 min。在最優(yōu)處方下制備的Cur-PLGA-NPs進(jìn)行了表征，包封率為(49.1±1.68)%，載藥量為(4.5±0.15)%，平均粒徑為(167.5±4.3)nm。IR、XRD、DSC結(jié)果顯示，藥物晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定型狀態(tài)，藥物與載體之間不存在相互作用力。本實(shí)驗(yàn)成功制備Cur-PLGA-NPs，為Cur-PLGA-NPs的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。