吳 鑫, 余永波, 安 琳, 黃統(tǒng)輝

(徐州醫(yī)科大學(xué) 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221000)

癌癥是全球死亡率較高的疾病，隨著人口老齡化加劇，發(fā)病率持續(xù)升高[1-2]。近年來(lái)，盡管大量新型抗癌藥物應(yīng)用于臨床治，但由于癌癥多樣性及耐藥性的出現(xiàn)，死亡率仍然很高。因此，開發(fā)安全有效的新型抗癌藥物仍然是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

Scheme 1

杯芳烴是一類具有獨(dú)特空腔結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚物[3]，廣泛應(yīng)用于分子識(shí)別[4]、藥物載體[5]、抗菌[6]、抗腫瘤[7-8]等領(lǐng)域。其中，雜環(huán)杯芳烴由于雜原子及雜芳環(huán)的引入，可以更有效地調(diào)節(jié)空腔大小及電子密度[9-10]，一系列具有較好抗腫瘤活性的雜環(huán)杯芳烴被報(bào)道[11-12]。嘧啶氧基苯基與1,2,3-三氮唑是重要的雜環(huán)結(jié)構(gòu)片段，兩者的衍生物均具有良好的理化性質(zhì)及抗炎[13-14]、抗菌[15-16]、抗腫瘤[17-18]等生物活性。鑒于此，本課題組根據(jù)藥效團(tuán)和骨架躍遷原理，將具有潛在抗腫瘤活性的嘧啶氧基苯基片段引入杯芳烴骨架中，并利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)在于側(cè)鏈引入活性基團(tuán)1,2,3-三氮唑，設(shè)計(jì)、合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的、包含多潛在抗腫瘤活性官能團(tuán)的含1,2,3-三氮唑基團(tuán)的四氧雜杯[2]芳烴[2]嘧啶衍生物。

本文以4-氯-2-甲硫基-6-丙炔氧基嘧啶為原料，依次經(jīng)Williamson醚合成、氧化和聚合反應(yīng)制得新型四氧雜杯[2]芳烴[2]嘧啶母體(4)，并通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成了4個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的含1,2,3-三氮唑基團(tuán)的四氧雜杯[2]芳烴[2]嘧啶衍生物(5a～5d, Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H MNR，13C MNR和HR-MS(ESI)表征并用MTT法驗(yàn)證了5a～5d對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(Hela)，人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，人肝癌細(xì)胞(HepG2)和人肺癌細(xì)胞(A549)的體外抗腫瘤活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

YRT-3型熔點(diǎn)儀；ZF-20D型暗箱式紫外分析儀；JNM-ECZR 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker maXis 4G UHR-TOF型質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 中間體2的合成

在500 mL的茄形瓶中加入間苯二酚3.30 g(30.0 mmol)， 3,5-二羥基苯甲酸甲酯5.04 g(30.0 mmol)，碳酸銫14.43 g(44.4 mmol)和乙腈300 mL，室溫?cái)嚢?0 min，隨后加入112.96 g(60.0 mmol)，移至75 ℃油浴中反應(yīng)48 h(TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束)。冷卻，抽濾，干燥脫溶，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=石油醚/乙酸乙酯5/1,V/V)純化得白色固體2，收率43%, m.p.122.5～128.2 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.76(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.23～7.19(m, 1H), 6.44(s, 2H), 5.10(d,J=2.3 Hz, 4H), 3.91(d,J=3.6 Hz, 3H), 3.18(s, 6H), 2.56(t,J=2.4 Hz, 2H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 171.5, 170.6, 164.9, 164.8, 152.8, 133.3, 120.4, 119.5, 95.0, 76.9, 76.4, 56.0, 52.9, 38.9; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C24H21N4O6S2{[M+H]+}525.1, found 525.1。

(2) 中間體3的合成

將中間體22.33 g(5.0 mmol)溶于80 mL二氯甲烷中，分批次加入m-CPBA 2.85 g(15 mmol)，氬氣保護(hù)下常溫反應(yīng)5 h(TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束)。抽濾，脫溶，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2/1)純化得中間體白色固體3，收率85%, m.p.116.5～118.7 ℃;1H NMR(DMSO, 400 MHz)δ: 7.83～7.71(m, 3H), 6.84(d,J=2.5 Hz, 2H), 5.14～5.11(m, 4H), 3.83(d,J=2.2 Hz, 3H), 3.72～3.64(m, 2H), 3.25(d,J=2.3 Hz, 6H);13C NMR(DMSO, 100 MHz)δ: 171.5, 170.6, 164.9, 164.8, 152.8, 133.3, 120.4, 119.5, 95.0, 76.9, 76.4, 56.0, 52.9, 38.9; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C24H20N4O10S2{[M+Na]+}611.0531, found 611.0448。

(3) 中間體4的合成

在500 mL的茄形瓶中加入間苯二酚1.32 g(12.0 mmol)， 3,5-二羥基苯甲酸甲酯2.17 g(12.0 mmol)，碳酸銫7.8 g(24 mmol)，乙腈300 mL。室溫?cái)嚢?0 min后，加入中間體36.36 g(12.0 mmol)，移至75 ℃油浴中反應(yīng)3 h(TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束)。冷卻，抽濾，脫溶，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=1/1)純化得白色固體4，收率37%, m.p.85.4～87.6 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.47(d,J=2.1 Hz, 2H), 7.41(d,J=2.1 Hz, 2H), 6.89～6.86(m, 1H), 6.78～6.75(m, 1H), 6.13(s, 1H), 5.07(d,J=2.4 Hz, 4H), 3.87(d,J=0.8 Hz, 6H), 2.58(t,J=2.3 Hz, 2H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 172.5, 171.7, 165.4, 164.1, 152.9, 132.3, 121.6, 120.8, 86.7, 77.7, 75.7, 54.9, 52.5; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C30H21N4O10{[M+H]+}597.1, found 597.1。

(4) 化合物5a～5d的合成(以5a為例)

將4-(3-疊氮丙氧基)吡啶0.125 g(0.55 mmol)和中間體40.149 g(0.25 mmol)溶于10 mL DMF，加入催化劑CuSO4·5H2O 0.030 g(0.10 mmol)和抗壞血酸鈉0.050 g(0.25 mmol)，90 ℃下反應(yīng)2 h(TLC跟蹤反應(yīng)至結(jié)束)。冷卻，加水析出固體，抽濾，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:A=2/1)純化得目標(biāo)化合物5a。

5a: 黃色固體，收率21%, m.p.125.4～127.1 ℃;1H NMR(DMSO, 400 MHz)δ: 8.27(s, 2H), 7.65(d,J=7.6 Hz, 4H), 7.37(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.32(d,J=2.2 Hz, 2H), 7.26(t,J=2.2 Hz, 1H), 7.17(t,J=2.2 Hz, 1H), 6.36(s, 2H), 6.08(d,J=7.6 Hz, 4H), 5.47(s, 4H), 4.38(t,J=7.0 Hz, 4H), 3.89(t,J=7.0 Hz, 4H), 3.76(d,J=5.0 Hz, 6H), 2.34～2.20(m, 4H);13C NMR(DMSO, 100 MHz)δ: 177.5, 173.3, 171.6, 165.1, 165.0, 164.0, 153.6, 153.4, 142.3, 141.5, 125.7, 120.1, 118.0, 87.1, 60.7, 53.3, 53.0, 47.1, 31.2; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C46H40N12O12{[M+H]+}953.2961, found 953.2966。

5b: 白色固體，收率10%, m.p.133.0～135.4 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 7.96(s, 2H), 7.60(d,J=9.5 Hz, 2H), 7.43(d,J=1.8 Hz, 2H), 7.37(d,J=1.9 Hz, 2H), 7.34(d,J=8.4 Hz, 2H), 6.86～6.69(m, 6H), 6.26(d,J=9.5 Hz, 2H), 6.06(s, 2H), 5.59(s, 4H), 4.84(t,J=4.5 Hz, 4H), 4.46(t,J=4.6 Hz, 4H), 3.86(d,J=2.8 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 173.1, 171.6, 165.3, 164.1, 161.0, 160.8, 155.8, 153.0, 152.9, 143.3, 143.1, 129.2, 125.3, 121.6, 120.7, 113.9, 113.4, 112.6, 101.7, 86.7, 66.8, 60.3, 52.5, 49.6; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C52H38N10O16{[M+H]+}1059.254 0, found 1059.252 5。

5c: 白色固體，收率17.6%, m.p.116.3～118.7 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.78(s, 2H), 8.04(t,J=8.2 Hz, 4H), 7.98(s, 2H), 7.46～7.43(m, 2H), 7.41～7.33(m, 6H), 7.04(s, 2H), 6.83(dd,J=3.5 Hz,J=2.0 Hz, 1H), 6.74(dd,J=3.6 Hz,J=2.0 Hz, 1H), 6.04(d,J=1.5 Hz, 2H), 5.58(s, 4H), 4.87(t,J=4.7 Hz, 4H), 4.52(t,J=4.7 Hz, 4H), 3.85(s, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 173.1, 171.6, 165.3, 164.1, 156.0, 153.0, 152.9, 148.2, 144.2, 143.1, 135.4, 131.0, 129.2, 125.3, 122.2, 121.7, 121.6, 120.7, 106.6, 86.7, 66.7, 60.3, 52.5, 49.8; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C52H40N12O12{[M+H]+}1025.2961, found 1025.2972。

5d: 黃色固體，收率11.2%, m.p.142.6～145.1 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.07(d,J=7.0 Hz, 2H), 8.00(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.74～7.65(m, 2H), 7.54(s, 2H), 7.49(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.40(d,J=2.1 Hz, 4H), 7.37～7.29(m, 2H), 6.76～6.68(m, 2H), 6.48(d,J=7.1 Hz, 2H), 5.95(s, 2H), 5.41(s, 4H), 4.79(t,J=5.8 Hz, 4H), 4.44(t,J=5.8 Hz, 4H), 3.88(d,J=2.7 Hz, 6H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 172.9, 171.5, 168.2, 165.3, 164.0, 152.9, 143.0, 138.5, 132.3, 131.4, 129.2, 128.9, 128.6, 125.8, 125.2, 125.0, 124.7, 120.8, 120.7, 104.7, 86.6, 60.1, 52.5, 49.2, 42.1, 41.0; HR-MS(ESI)m/z： Calcd for C56H40N12O12{[M+H]+}1073.2961, found 1073.2980。

1.2 性能或活性測(cè)試

采用MTT法研究化合物5a～5d對(duì)MCF-7、 HepG2、 A549、 HeLa的體外抗增殖活性。以5-氟尿嘧啶為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)試目標(biāo)化合物的單濃度抑制率。設(shè)定給藥濃度為50 μM，作用時(shí)間為72 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔[19-20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

合成3的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，間氯過(guò)氧苯甲酸需分批次加入，否則反應(yīng)過(guò)于劇烈，影響收率。在以中間體4合成目標(biāo)化合物5a～5d的過(guò)程中，探索了不同的催化劑、溶劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)收率的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)使用CuI或抗壞血酸鈉作為催化劑時(shí)，收率顯著低于使用CuSO4·5H2O與抗壞血酸鈉的收率；在DMF、 PEG-600、 DMSO、 THF等多種溶劑中，以DMF作為溶劑時(shí)收率最高；反應(yīng)最佳溫度為90 ℃，反應(yīng)溫度降低時(shí)，收率隨之降低；反應(yīng)溫度升高時(shí)，TLC檢測(cè)反應(yīng)雜質(zhì)增多，收率亦降低；反應(yīng)2 h原料基本反應(yīng)完全，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至4 h，反應(yīng)雜質(zhì)增多，收率降低。

2.2 抗腫瘤活性

表1為化合物5a～5d對(duì)Hela、 MCF-7、 HegG2和A549的體外抗腫瘤活性及其油水分配系數(shù)LogP值。由表1可見，化合物5a～5d對(duì)腫瘤細(xì)胞顯示出不同程度的抗增殖作用。其中，化合物5a對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，其在50 μM濃度下對(duì)MCF-7的抑制率可達(dá)82%，是陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶的2.6倍；對(duì)A549的抑制率為53.9%，略低于5-氟尿嘧啶(5-FU)；對(duì)Hela和HegG2的細(xì)胞毒性較差，顯示出一定的選擇性。化合物5b～5d的抗腫瘤活性相對(duì)較弱，其中化合物5d表現(xiàn)出最弱的抗增殖活性，可能與其較高的親脂性有關(guān)(LogP=9.58)。基于此，推測(cè)此類化合物的抗腫瘤活性可能與親脂性有關(guān)，當(dāng)引入基團(tuán)親脂性過(guò)高時(shí)，化合物溶解性差，抗腫瘤活性降低。因此，后續(xù)的優(yōu)化將集中在引入水溶性基團(tuán)以改善其油水分配系數(shù)，提升抗腫瘤活性方面。

表1 5a～5d的構(gòu)效關(guān)系

a5a～5d的濃度為50 μM；bLogP值由Molsoft軟件計(jì)算。

以4-氯-2-甲硫基-6-丙炔氧基嘧啶為原料，設(shè)計(jì)并合成了4個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的含1,2,3-三氮唑基團(tuán)的四氧雜杯[2]芳烴[2]嘧啶衍生物(5a～5d)，并采用MTT法初步評(píng)價(jià)了其體外抗腫瘤活性。結(jié)果表明，化合物5a對(duì)MCF-7具有明顯的抑制活性，在50 μM濃度下抑制率可達(dá)82%，優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶，具有潛在的臨床價(jià)值。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化與生物活性研究正在進(jìn)行中。