張代群 李 峰 王淑敏 張 凱 石曉娟 張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,鄭州 450052)

嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞已經(jīng)在血液惡性腫瘤臨床應(yīng)用中取得了較好的臨床效果[1]。但是，CAR-T細(xì)胞在治療實(shí)體瘤方面并沒有取得預(yù)期的療效，其中CAR-T細(xì)胞在應(yīng)用過程中產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)是主要原因之一[2]。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2，也稱為Her-2/neu或ErbB2)是跨膜表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員，在多種腫瘤細(xì)胞表面呈高水平表達(dá)，可被用作CAR-T細(xì)胞治療的靶點(diǎn)[3，4]。然而，2010年Morgan等[5]報(bào)道了一名ErbB2高表達(dá)的結(jié)腸癌患者接受ErbB2-CAR-T細(xì)胞治療的病例，患者在接受細(xì)胞回輸15 min后出現(xiàn)呼吸困難，最終在5 d后死亡，可能是因?yàn)榛颊叻尾看嬖诘退降腅rbB2表達(dá)，使CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，從而攻擊正常的肺部組織。為了消除這種脫靶效應(yīng)，通過改變單鏈可變區(qū)(scFv)降低CAR結(jié)合域?qū)Π袠?biāo)的親和力已成為一種流行的策略[6，7]，但是，降低CAR親和力也可能會(huì)減弱抗腫瘤功能的效力[8]。因此，關(guān)鍵是要確定能夠達(dá)到最好的抗腫瘤效果并且不會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的條件。本課題組應(yīng)用靶向ErbB2的兩種低親和力的scFv——FRP5(KD=30 nmol/L)和chA21(KD=11 nmol/L)作為CAR的細(xì)胞外結(jié)合域[9,10]，其中chA21的親和力高于FRP5，通過對(duì)比兩種CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用、細(xì)胞因子分泌以及形成免疫突觸的能力，證明chA21-CAR-T能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，并且不會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1材料 MCF-7、MRC-5和293T細(xì)胞均購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))，胎牛血清購(gòu)自HyClone公司(美國(guó))，青鏈霉素混合溶液購(gòu)自Gibco公司(美國(guó))，人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?，Human CD8 microbeads購(gòu)自美天旎公司(德國(guó))，Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28、Lipofectamine 3000、eBioscienceTMCell Proliferation Dye eFluorTM670購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司(美國(guó))，ELISA試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)所用熒光抗體均購(gòu)自Biolegend公司(美國(guó))，重組人白介素2購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 采集20 ml健康志愿者的外周血于無(wú)菌的肝素抗凝采血管中，1 500 r/min 離心10 min后棄上層血漿，將下層細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50 ml無(wú)菌離心管，加入無(wú)菌PBS稀釋至30 ml 后輕晃混勻，另取一個(gè)50 ml無(wú)菌離心管，加入15 ml外周血淋巴細(xì)胞分離液。將稀釋后的血液傾倒于淋巴細(xì)胞分離液的液面上。2 500 r/min離心25 min；用無(wú)菌移液管吸取中間白膜層至另一無(wú)菌50 ml離心管中，加無(wú)菌PBS至50 ml，1 500 r/min離心10 min，外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)在沉淀中。

1.2.2分選及培養(yǎng)CD8+T細(xì)胞 通過細(xì)胞免疫磁珠分選法獲得CD8+T細(xì)胞。用磁珠分選緩沖液重懸PBMC，1 500 r/min離心5 min后棄上清。顯微鏡下計(jì)數(shù)后，每1×107個(gè)細(xì)胞避光加入20 μl人CD8磁珠和80 μl磁分選緩沖液，混勻后置于4℃避光孵育20 min。1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入適量磁分選緩沖液重懸細(xì)胞。在磁分選磁場(chǎng)中固定磁分選柱子，用磁分選緩沖液潤(rùn)洗柱子后緩慢加入細(xì)胞懸液，待全部細(xì)胞通過柱子后，用磁分選緩沖液清洗柱子2次。將柱子從磁場(chǎng)中取出，用活塞快速加壓將細(xì)胞收集至離心管內(nèi)，離心棄上清，沉淀即為CD8+T細(xì)胞。用加了人IL-2重組蛋白的含10%胎牛血清的RPMI1640重懸后，將細(xì)胞鋪于12孔板中，同時(shí)加入CD3/CD28 beads活化。

1.2.3制備及培養(yǎng)FRP5-CAR-T與chA21-CAR-T細(xì)胞 合成FRP5-4-1BB-CAR與chA21-4-1BB-CAR的序列，CAR結(jié)構(gòu)包括CD8α導(dǎo)肽、FRP5或chA21的單鏈可變區(qū)序列(scFv)、CD8α鉸鏈區(qū)與跨膜區(qū)、4-1BB、CD3ζ信號(hào)及2A剪切肽(P2A)，并連接綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，將其亞克隆入慢病毒載體中，獲得質(zhì)粒，測(cè)序鑒定正確后，通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得病毒上清，感染CD8+T細(xì)胞獲得CAR-T細(xì)胞。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 收集對(duì)照組(UTD)T細(xì)胞及CAR-T細(xì)胞各1×105個(gè)，1 500 r/min離心5 min后棄上清，用PBS清洗后用200 μl的PBS重懸細(xì)胞，以UTD組的T細(xì)胞為對(duì)照，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GFP表達(dá)效率。

1.2.5血球計(jì)數(shù)法檢測(cè)T細(xì)胞增殖能力 將CAR-T細(xì)胞各5×106個(gè)/孔的初始數(shù)量鋪于12孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3天、第6天、第9天和第12天收取細(xì)胞，混勻后吸取10 μl于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，比較CAR-T細(xì)胞的增殖能力。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞的分化狀態(tài) 收取T細(xì)胞1×105個(gè)于1.5 ml EP管，避光加入CD8-APC-Cy7、CD45RA-APC、CD62L-PE，4℃孵育20 min后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CD45RA+CD62L+為初始T細(xì)胞(na?ve T cells，Tn)，CD45RA+CD62L-為效應(yīng)T細(xì)胞(effector T cells,Teff),CD45RA-CD62L+為中心記憶性T細(xì)胞(center memory T cells，Tcm)，CD45RA-CD62L-為效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells,Tem)。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ErbB2的表達(dá)水平 收集MRC-5和MCF-7兩種細(xì)胞各1×105個(gè)于1.5 ml EP管，F(xiàn)low buffer洗滌后避光加入流式抗體ErbB2-APC，以同型對(duì)照為參考，4℃避光孵育 20 min 后于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8ELISA檢測(cè)功能性分子的分泌水平 分別用UTD組T細(xì)胞、FRP5-CAR-T細(xì)胞、chA21-CAR-T細(xì)胞與MRC-5、MCF-7細(xì)胞共孵育24 h，1 500 r/min離心5 min后收集上清，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)上清中T細(xì)胞效應(yīng)分子IL-2、IFN-γ分泌量的差異。

1.2.9CAR-T細(xì)胞殺傷能力的檢測(cè) 用轉(zhuǎn)染空載體的T細(xì)胞、FRP5-CAR-T細(xì)胞和chA21-CAR-T細(xì)胞分別與熒光素酶轉(zhuǎn)基因的MRC-5和MCF-7細(xì)胞按照0∶1、1∶1、5∶1和20∶1 的效靶比共孵育24 h后，加入熒光素底物后在活體成像儀下檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化，以熒光強(qiáng)度代表腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。

1.2.10成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫突觸 腫瘤細(xì)胞用eBioscienceTMCell Proliferation Dye eFluorTM670染料，再用F-actin染料分別標(biāo)記腫瘤細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞，最后將兩種細(xì)胞在37℃共孵育30 min，用成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫突觸的形成，用Image J分析形成突觸的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建FRP5-CAR-T和chA21-CAR-T細(xì)胞 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別構(gòu)建了靶向ErbB-2抗原的FRP5 4-1BB-CAR(KD=30 nmol/L)[11]和chA21 4-1BB-CAR(KD=11 nmol/L)[12](圖1A)；利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法，成功構(gòu)建兩種CAR-T細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，F(xiàn)RP5：44.2%，chA21：44.5%(圖1B)；用Fab染色的方法證明CAR分子在細(xì)胞表面的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1C)。

2.2檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的增殖能力和分化情況 FRP5-CAR-T細(xì)胞及chA21-CAR-T細(xì)胞增殖能力和分化情況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A～C)，證明不同親和力的scFv不會(huì)對(duì)CAR-T細(xì)胞的增殖和表型有影響。

2.3CAR-T細(xì)胞對(duì)ErbB2low細(xì)胞和ErbB2hi細(xì)胞的殺傷能力 分別檢測(cè)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5和腫瘤細(xì)胞系MCF-7表達(dá)ErbB2的情況，MRC-5為ErbB2low，MCF-7為ErbB2high(圖3A)，統(tǒng)計(jì)平均熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)MRC-5表面ErbB2表達(dá)密度遠(yuǎn)低于MCF-7(P<0.05，圖3B)。隨后將兩種CAR-T細(xì)胞分別與轉(zhuǎn)入熒光素酶的MRC-5和MCF-7以不同效靶比共孵育24 h，以檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的殺傷能力，當(dāng)效靶比為5∶1和10∶1時(shí)可以看出，chA21-CAR-T細(xì)胞的殺傷能力顯著高于FRP5-CAR-T細(xì)胞(P<0.05，圖3C～F)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且沒有產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

圖1 CAR-T細(xì)胞構(gòu)建Fig.1 Construction of CAR-T cellsNote:A.Schematics of CAR molecule;B.GFP positive efficiency were detected by FACS day 4 after transduction;C.Fab staining for detection of CAR expression density.

圖2 CAR-T細(xì)胞的增殖和分化Fig.2 Proliferation and differentiation of CAR-T cellsNote:A.Expansion curve of CAR-T cells;B,C.Phenotypes of CAR-T cells were detected using CD62L and CD45RA antibodies by FACS.

圖3 scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞抗腫瘤能力的影響Fig.3 Effect of scFv affinity on anti-tumor ability of CAR-T cellsNote:A，B.Detected cell surface ErbB2 expression levels by FACS,data were analyzed by student t test,*.P<0.05 vs MRC-5 group；C-F.Co-culture CAR-T cells with MRC-5 and MCF-7 cells with E∶T=0∶1,1∶1,5∶1,20∶1,and determined antitumor efficiency by IVIS imaging;*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖4 scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.4 Effect of scFv affinity on secretion of cytokines by CAR-T cellsNote:A，B.Determination of IFN-γ and IL-2 concentrations in co-incubated supernatants.*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖5 scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期抗腫瘤能力的影響Fig.5 Effect of scFv affinity on long-term anti-tumor ability of CAR-T cellsNote:A.Co-culture CAR-T cells with MCF-7 cells with E∶T=1∶1,and determined antitumor efficiency by IVIS imaging；B.Fluorescence intensity chart.*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

圖6 scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞形成免疫突觸的影響Fig.6 scFv affects ability of CAR-T cells to form imm-une synapsesNote:A.Co-culture CAR-T cells with MCF-7 cells,and detected immune synapses by imaging flow；B.Statistical analysis of immune synaptic MFI using image J software;*.P<0.05 vs UTD group;#.P<0.05 vs FRP5-CAR-T group.

2.4scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的影響 收取CAR-T和腫瘤細(xì)胞共孵育的上清，用ELISA方法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況，發(fā)現(xiàn)chA21-CAR-T細(xì)胞比FRP5-CAR-T細(xì)胞分泌更多的IL-2和IFN-γ(P<0.05，圖4)。

2.5scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞長(zhǎng)期抗腫瘤能力的影響 將CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞按1∶1的效靶比以每種細(xì)胞1×105個(gè)/孔的密度鋪到12孔板中，持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，chA21-CAR-T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯強(qiáng)于FRP5-CAR-T細(xì)胞(P<0.05,圖5)。

2.6scFv親和力對(duì)CAR-T細(xì)胞形成免疫突觸的影響 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)通過與靶細(xì)胞形成免疫突觸并向細(xì)胞間隙分泌顆粒酶和疏水性蛋白穿孔素而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。檢測(cè)不同親和力scFv對(duì)CAR-T細(xì)胞形成免疫突觸能力的影響，首先標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，再用F-actin對(duì)CAR-T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分別染色，共孵育后，用成像流式細(xì)胞儀檢測(cè)形成免疫突觸的情況，結(jié)果顯示chA21-CAR-T形成免疫突觸的能力更強(qiáng)(P<0.05,圖6)。

3 討論

由于CAR-T細(xì)胞在靶向腫瘤相關(guān)抗原時(shí)會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，這很大程度上限制了CAR-T療法在實(shí)體瘤中的應(yīng)用。脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的主要原因是缺少理想靶點(diǎn)[12,13]，因此，調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞對(duì)靶抗原的親和力來避免脫靶效應(yīng)是一種可行的策略[14]，降低CAR對(duì)靶標(biāo)的親和力會(huì)提高CAR-T細(xì)胞活化的閾值，避免過度活化從而保持記憶表型[15,16]，使CAR-T細(xì)胞能夠長(zhǎng)期存活，但同時(shí)也會(huì)一定程度阻礙抗腫瘤效力[9,10]，因此提高CAR-T治療效率和安全性的關(guān)鍵是平衡抗原識(shí)別和脫靶效應(yīng)。

ErbB2是目前研究最多的腫瘤相關(guān)抗原之一，本研究成功構(gòu)建了靶向ErbB2的兩種不同親和力scFv的CAR-T細(xì)胞，結(jié)果顯示，兩種CAR-T細(xì)胞均不會(huì)靶向低水平表達(dá)靶抗原的正常成纖維細(xì)胞，同時(shí)，更高親和力的chA21-CAR-T細(xì)胞的腫瘤殺傷效果和細(xì)胞因子分泌水平更高，且具有更強(qiáng)的長(zhǎng)期抗腫瘤能力。

預(yù)防CAR-T細(xì)胞治療所產(chǎn)生的脫靶效應(yīng)有很多途徑，如在降低scFv親和力的同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)共刺激信號(hào)，降低CAR-T細(xì)胞活化的閾值，使CAR-T細(xì)胞更容易被活化[10]。本課題提出調(diào)節(jié)scFv親和力使其在抗腫瘤效力與防止脫靶效應(yīng)之間保持平衡，為CAR-T細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用提供新的思路。