史 銳 朱振軍 楊永波 (新鄉(xiāng)中心醫(yī)院骨科，新鄉(xiāng) 453000)

隨著人口老齡化不斷加重，下腰痛已成為很普遍的健康隱患，給患者家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。椎間盤(pán)是機(jī)體完成脊柱運(yùn)動(dòng)、負(fù)重和柔韌性能的基礎(chǔ)，但易受損傷而發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，包括年齡、損傷等因素[2]，椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是臨床引起下腰痛的主要原因，其治療包括保守治療、椎間盤(pán)切除和脊柱融合，但均不能從根本上阻止其退變[3,4]。研究表明，炎癥微環(huán)境和新的神經(jīng)支配產(chǎn)生是椎間盤(pán)性疼痛的來(lái)源，包括IL-1β在內(nèi)的許多炎癥因子分泌增加都會(huì)促進(jìn)椎間盤(pán)退變；同時(shí)，IL-1β還能影響椎間盤(pán)細(xì)胞衰老、自噬和與增殖、再生有關(guān)的基因表達(dá)[5,6]。因此，抑制IL-1β可能是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)椎間盤(pán)退變的重要治療靶點(diǎn)。?；撬?taurine)，又名2-氨基-乙磺酸，因首次分離自牛的膽汁而得名，大量研究表明，?；撬崾蔷哂锌寡趸?、抗炎、抗細(xì)胞凋亡和神經(jīng)保護(hù)功能的游離的細(xì)胞內(nèi)β氨基酸[7-9]。但關(guān)于牛磺酸對(duì)髓核細(xì)胞炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激的影響鮮少報(bào)道，基于此本文采用原代培養(yǎng)的大鼠髓核細(xì)胞，以IL-1β誘導(dǎo)建立椎間盤(pán)退變大鼠髓核細(xì)胞模型，探究?；撬釋?duì)椎間盤(pán)退變大鼠髓核細(xì)胞模型細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠購(gòu)自維通利華公司；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司；Hochest33342凋亡檢測(cè)試劑盒(Solarbio 公司)；DMEM/F12培養(yǎng)液，青霉素、鏈霉素雙抗，0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；IL-1β、?；撬豳?gòu)自Sigma公司；總RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；甲苯胺藍(lán)試劑盒購(gòu)自Baso公司；番紅O試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；RT-PCR試劑購(gòu)自TransGen公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自 Nikon公司；6 孔培養(yǎng)板、24 孔培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司；凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)購(gòu)自SIM公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司；Caspase-3、Caspase-9、GAPDH引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；隔水式恒溫孵育箱、電子天平、全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫振蕩器及普通手術(shù)器械等購(gòu)自上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1髓核細(xì)胞分離培養(yǎng)[10,11]健康成年SD大鼠5只，體重(200±20)g，采用CO2麻醉致死法處死大鼠。將其放入75%酒精浸泡對(duì)體表進(jìn)行消毒，再移入凈化工作臺(tái)內(nèi)，在無(wú)菌條件下分離胸腰段脊柱，再仔細(xì)剝離脊柱周?chē)嘤嗟募∪饨M織，使椎間盤(pán)充分暴露，最后小心劃開(kāi)纖維環(huán)獲取白色凝膠樣髓核組織。將獲得的組織用PBS液反復(fù)洗滌，以去除破碎的其他組織及血漬，再將其切成約1 mm3的小碎塊，移入滅菌離心管中，用0.1% Ⅱ 型膠原酶將其淹沒(méi)。在37℃恒溫振蕩器中振蕩消化0.5 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS液離心漂洗3次，棄離心液備用。再用0.1% Ⅱ 型膠原酶重懸離心后的組織塊，在37℃、5%CO2條件下孵育4 h，最后將上述細(xì)胞懸液用 70 μm孔徑的細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾。將得到的細(xì)胞用DMEM/F-12離心洗滌3次，轉(zhuǎn)入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5 d 后首次換液，去除漂浮組織塊，以后每3 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到85%時(shí)可進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡觀察每代細(xì)胞形態(tài)，第2代細(xì)胞用于細(xì)胞鑒定，第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察 采用番紅染色和甲苯胺藍(lán)染色鑒定髓核細(xì)胞。將第2 代細(xì)胞接種于24 孔板，細(xì)胞貼壁后去除原培養(yǎng)液，用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，后用PBS漂洗5 min×3次，1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，0.5%番紅O染液滴染1 min，雙蒸水洗滌1 min，鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.3椎間盤(pán)退變大鼠髓核細(xì)胞模型建立及給藥 將第3代髓核細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組，Ctrl組(空白對(duì)照組)、IL-1β組(10 ng/ml)、IL-1β+Taurine組(100 μg/ml)、IL-1β+Taurine組(200 μg/ml)和IL-1β+Taurine組(400 μg/ml)，將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Hochest33342染色檢測(cè)髓核細(xì)胞凋亡率 將上述各組細(xì)胞用PBS漂洗2遍，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入Hochest33342 1 ml染色15 min，去除染色液，PBS漂洗3次，鏡下觀察、拍照。

1.2.5蛋白印跡檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9的表達(dá) 將1.2.3所述細(xì)胞用RIPA蛋白裂解液于冰上提取總蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度并調(diào)平。每組取等量蛋白質(zhì)用12%SDS-PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。室溫封閉蛋白質(zhì) 2 h，以1∶1 000的濃度加入Caspase-3、Caspase-9一抗，4℃孵育過(guò)夜。第二天棄去一抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入二抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.6檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量 按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)1.2.3所述各組髓核細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激因子SOD、 MDA、GSH和LDH的含量。

1.2.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10的表達(dá) 按照說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)1.2.3所述各組髓核細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10的表達(dá)水平。

1.2.8Western blot檢測(cè)NF-κB p65的磷酸化和TNF-α的表達(dá)水平 用1.2.4所述方法檢測(cè)NF-κB p65、p-p65(即p-p65/p65相對(duì)表示水平)、TNF-α的表達(dá)，以評(píng)價(jià)NF-κB p65的磷酸化水平和TNF-α的表達(dá)水平。

1.2.9免疫熒光檢測(cè)p65的入核情況 將1.2.3所述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用PBS漂洗細(xì)胞2遍，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室溫染色5 min，輕輕吸去染液，PBS漂洗3次，鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1髓核細(xì)胞的鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶分離培養(yǎng)原代髓核細(xì)胞，對(duì)第2代髓核細(xì)胞進(jìn)行番紅和甲苯胺藍(lán)染色對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：如圖1所示，經(jīng)番紅染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均被染成棕黃色；而經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)被染成天藍(lán)色，且靠細(xì)胞核越近染色越深；當(dāng)兩者染色后均可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)三角形或多邊形的“鋪路石”樣，細(xì)胞形態(tài)符合軟骨細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，因髓核細(xì)胞是特殊類(lèi)型的軟骨細(xì)胞，故可說(shuō)明髓核細(xì)胞分離成功。

2.2?；撬釋?duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的影響 用Hochest33342對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行凋亡率檢測(cè)，結(jié)果如圖2A、B所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細(xì)胞核固縮、染色加深明顯，細(xì)胞凋亡率顯著上調(diào)(P<0.01)；經(jīng)牛磺酸處理后，各模型加藥組細(xì)胞核固縮、染色加深程度降低，細(xì)胞凋亡率較IL-1β組均下調(diào)(P<0.01)，且這種下調(diào)作用隨?；撬釢舛鹊脑黾佣鰪?qiáng)。另外，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示，如圖2C所示：與Ctrl組相比，IL-1β組Caspase-3、9的相對(duì)蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.01)；而經(jīng)?；撬崽幚砗?，隨牛磺酸濃度的增大Caspase-3、9的相對(duì)蛋白表達(dá)水平較Ctrl組均明顯下調(diào)(P<0.01)。

綜上所述，IL-1β能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞發(fā)生凋亡，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、-9的表達(dá)，而?；撬峥梢载?fù)向調(diào)節(jié)其對(duì)髓核細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、-9表達(dá)的上調(diào)作用。

2.3牛磺酸對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激因子SOD、 MDA、GSH和LDH含量的影響 檢測(cè)各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子的含量，結(jié)果如圖3所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細(xì)胞SOD、GSH含量顯著降低(P<0.01)，MDA、LDH含量顯著升高(P<0.01)；經(jīng)不同濃度?；撬嶙饔煤螅髂Ｐ图铀幗M細(xì)胞SOD、GSH含量較IL-1β組呈?；撬釀┝恳蕾?lài)性的升高，同時(shí)MDA、LDH含量隨?；撬釢舛仍黾佣档?P<0.01)。說(shuō)明，IL-1β能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生MDA、LDH，降解SOD、GSH，而?；撬峥梢詣┝恳蕾?lài)性地減弱IL-1β對(duì)上述氧化應(yīng)激因子的作用。

圖1 番紅染色和甲苯胺藍(lán)染色鑒定髓核細(xì)胞Fig.1 Nucleus pulposus cells were identified by safranin O staining and toluidine blue staining

圖2 ?；撬釋?duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響Fig.2 Effects of taurine on apoptosis rate of NP cells induced by IL-1β and expression of apoptosis related factorsNote:A.Apoptosis detected by Hochest33342；B.Statistical analysis of apoptosis rate in NP cells；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the Caspase-3，9 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

圖3 ?；撬釋?duì)髓核細(xì)胞氧化應(yīng)激因子含量的影響Fig.3 Effects of taurine on content of oxidative stress factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

圖4 ?；撬釋?duì)髓核細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of taurine on protein level of inflammatory factors in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.4?；撬釋?duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞炎癥因子IL-6、iNOS、IL-10表達(dá)水平的影響 采用ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示：與Ctrl組相比，IL-1β組細(xì)胞IL-6、iNOS表達(dá)被顯著上調(diào)(P<0.01)，而IL-10表達(dá)呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)(P<0.01)；當(dāng)用不同濃度?；撬嶙饔煤?，各模型加藥組細(xì)胞IL-6、iNOS表達(dá)水平較IL-1β組呈?；撬釀┝恳蕾?lài)性的降低，同時(shí)IL-10的表達(dá)隨牛磺酸濃度增加而明顯上調(diào)(P<0.01)。說(shuō)明，IL-1β能誘導(dǎo)髓核細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、iNOS，同時(shí)促進(jìn)IL-10的降解，而?；撬峥梢詣┝恳蕾?lài)性地減弱IL-1β對(duì)上述炎癥因子的調(diào)節(jié)作用。

圖5 牛磺酸對(duì)NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達(dá)和p65入核的影響Fig.5 Effects of taurine on NF-κB p65 phosphorylation,TNF-α expression and p65 entry in IL-1β-treated nucleus pulposus cellsNote:A.Immunofluorescence method was used to detect the nucleation of p65；B.Statistical analysis of nucleation of p65；C.Western blot analysis demonstrating the effect of taurine on the TNF-α，p-p65 and NF-κB p65 protein expression levels and the statistical analysis of them.**.P<0.01 versus Ctrl group;##.P<0.01 versus IL-1β group.

2.5?；撬釋?duì)IL-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達(dá)和p65入核情況的影響 采用免疫熒光法檢測(cè)p65的入核情況，結(jié)果如圖5A、B顯示：IL-1β組細(xì)胞核內(nèi)熒光量較Ctrl組明顯增加(P<0.01)；而與IL-1β組相比，各模型加藥組細(xì)胞核內(nèi)熒光量明顯減少(P<0.01)，且隨著?；撬釢舛鹊脑黾樱瑹晒饬恐饾u減少。說(shuō)明，?；撬崮軇┝恳蕾?lài)性減少p65的入核量。

蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組髓核細(xì)胞NF-κB p65磷酸化情況，以及TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果如圖5C所示：與Ctrl組相比，IL-1β組p-p65/p65、TNF-α表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.01)；同時(shí)，各模型加藥組p-p65/p65、TNF-α表達(dá)水平較IL-1β組均呈顯著下降(P<0.01)，且隨?；撬釢舛鹊脑黾酉陆党潭纫仓饾u增強(qiáng)。說(shuō)明?；撬峥梢载?fù)向調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化和TNF-α表達(dá)水平。

3 討論

IL-1β是促炎性細(xì)胞因子IL-1家族的一員，是參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，能加劇慢性疾病和急性組織損傷，包括炎癥性腸病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、各種自身免疫和自身炎癥疾病，IL-1β表達(dá)上調(diào)能增加椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而加速椎間盤(pán)退變進(jìn)程[12-17]。本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型膠原酶法成功分離大鼠髓核細(xì)胞，并用10 ng/ml IL-1β處理髓核細(xì)胞以建立椎間盤(pán)退化細(xì)胞模型。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是多種疾病得以發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，研究表明?；撬峋哂幸种芅MDA誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用[18]。體內(nèi)研究也證實(shí)，在老化和退變的椎間盤(pán)中存在氧化應(yīng)激和氧化產(chǎn)物濃度的增加，前者通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起髓核細(xì)胞活性下降，過(guò)早凋亡和衰老，是椎間盤(pán)退變的發(fā)病機(jī)制之一[19，20]。本實(shí)驗(yàn)以成功培養(yǎng)的第3代大鼠髓核細(xì)胞為研究對(duì)象，用不同濃度的?；撬崽幚砟Ｐ图铀幗M細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)?；撬崮芙档虸L-1β誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡率。另外，研究表明髓核細(xì)胞的凋亡可能與Caspase-3、Bcl-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，?；撬嵋种屏薎L-1β對(duì)髓核細(xì)胞中凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3、Caspase-9表達(dá)的上調(diào)，且其抑制作用與牛磺酸濃度呈正比。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明?；撬崮芙档退韬思?xì)胞的體外凋亡水平。

正常情況下，活性氧(ROS)的生成和去除應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)身體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)分子氧將集聚增加，脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高，最終導(dǎo)致DNA損傷和異常蛋白質(zhì)表達(dá)[22]。Rannou等[23]研究表明炎癥明顯的椎間盤(pán)會(huì)持續(xù)壓迫脊髓或神經(jīng)根，激活iNOS，產(chǎn)生大量NO，從而增加受損區(qū)域的iNOS表達(dá)水平。Esposito等[24]也證實(shí)，通過(guò)抑制IL-1β和iNOS的表達(dá)，能有效抑制β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。而大量研究發(fā)現(xiàn)，牛磺酸被認(rèn)為是一種抗氧化劑，可以抑制肥胖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和脂肪細(xì)胞的炎癥[25，26]，但其抗氧化性能的細(xì)胞機(jī)制尚未明確。腹腔注射牛磺酸可減輕黏菌素誘導(dǎo)的腎組織氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙[27]。本文研究表明，?；撬崮芙档退韬思?xì)胞內(nèi)IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激因子，從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低對(duì)髓核細(xì)胞的傷害。

NF-κB信號(hào)通路對(duì)炎癥性疾病起著重要作用，在骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞中，可見(jiàn)NF-κB p65磷酸化水平升高，進(jìn)而增加下游TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[28]。關(guān)于炎癥因子在椎間盤(pán)中的作用研究，Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、IL-4和腫瘤壞死因子均參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分解，在椎間盤(pán)細(xì)胞凋亡中起重要作用。而通過(guò)抑制NF-κB的磷酸化激活，能有效抑制TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而改善炎性損傷[30]。本文研究發(fā)現(xiàn)IL-1β能促進(jìn)NF-κB p65磷酸化、TNF-α表達(dá)和p65入核，但是這種促進(jìn)作用可以被牛磺酸劑量依賴(lài)性的弱化，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本文采用Ⅱ型膠原酶成功分離大鼠髓核細(xì)胞，并用10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)建立椎間盤(pán)退變細(xì)胞模型，以此作為研究對(duì)象初步探討?；撬釋?duì)椎間盤(pán)模型大鼠髓核細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，結(jié)果說(shuō)明?；撬峥梢酝ㄟ^(guò)抑制Caspase-3、-9表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，清除氧化產(chǎn)物自由基，抑制炎癥因子表達(dá)，降低NF-κB p65磷酸化水平，減少TNF-α表達(dá)和p65入核，實(shí)現(xiàn)對(duì)椎間盤(pán)退變模型大鼠髓核細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。本文的研究旨在為椎間盤(pán)退化的治療提供一個(gè)新的方向。