王 佳 梁葵香 劉艷妮 楊延冬 (濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，濱州 256603)

子宮肌瘤是育齡期婦女中常見的一種盆腔腫瘤，其臨床表現(xiàn)主要為月經(jīng)過多、習(xí)慣性流產(chǎn)等，發(fā)生率逐年升高[1]。研究表明子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡與子宮肌瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2]。因而基于子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制研發(fā)治療該疾病的有效藥物具有重要意義。相關(guān)報(bào)道指出茯苓具有活血化瘀的功效并可用于治療子宮肌瘤、慢性盆腔炎、子宮內(nèi)膜異位等婦科疾病，但具體作用機(jī)制尚未可知[3,4]。研究表明茯苓酸(pachymic acid，PA)是中藥茯苓的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤等作用，并可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)過程發(fā)揮抗癌作用[5]。但PA對(duì)子宮肌瘤抑制作用的研究尚未見報(bào)道。微小RNA-133a(microRNA-133a，miR-133a)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-133a的表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲[6]。但PA是否能夠通過調(diào)控miR-133a的表達(dá)從而影響子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展過程尚未可知。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associatedmacrophage，TAM)分泌的表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)可通過促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)表達(dá)從而促進(jìn)上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移[7]。本研究采用PA作用于子宮肌瘤細(xì)胞，探究其在體外抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制，分析其對(duì)miR-133a表達(dá)的調(diào)控作用及其對(duì)EGF水平的影響，為PA在子宮肌瘤治療方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑 PA購自上海晶都生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國(guó)Thermo Fisher公司；胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)購自美國(guó)依科賽生物公司；蛋白提取試劑盒均購自陜西碧云天生物工程有限公司；二 喹 啉 甲 酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Pierce公司；miR-133a模擬物(miR-133a mimics)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-133a特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-133a)及陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國(guó)Invitrogen公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自武漢艾美捷科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海潤(rùn)成生物科技有限公司；EGF酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人EGFR、CyclinD1、C-caspase-3抗體購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2研究對(duì)象 收集2016年4月至2017年4月病理證實(shí)為子宮肌瘤的手術(shù)切除標(biāo)本58例，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為子宮肌瘤；患者術(shù)前均未進(jìn)行放療或化療等治療?；颊吣挲g35～60歲，平均年齡(48.58±8.79)歲，病程2～6年，平均(3.56±1.03)年，子宮肌瘤組織平均體積(168.35±45.87)cm3。

1.1.3納入標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)中切除離體的宮頸標(biāo)本置于無RNA酶的EP管內(nèi)，放入液氮中，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2方法

1.2.1子宮肌瘤細(xì)胞原代培養(yǎng) 子宮肌瘤組織置于含有雙抗的PBS中培養(yǎng)5 min，剪碎組織，加入Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫浴鍋內(nèi)消化3 h，待組織塊變小后加入完全培養(yǎng)基終止消化，采用200目細(xì)胞篩過濾收集，4℃下1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。子宮肌瘤細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，分離子宮肌瘤細(xì)胞，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法染色鑒定子宮肌瘤細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究[8]。

1.2.2實(shí)驗(yàn)處理與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期子宮肌瘤細(xì)胞，采用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，用不同濃度的PA(10、20、40、80 μg/ml)處理子宮肌瘤細(xì)胞24 h，分別命名為PA 10 μg/ml組、PA 20 μg/ml組、PA 40 μg/ml組、PA 80 μg/ml組[9]。正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞命名為NC組。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，選用存活率為50%左右的PA濃度用于后續(xù)研究。觀察miR-133a過表達(dá)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響，實(shí)驗(yàn)分為miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至子宮肌瘤細(xì)胞)、miR-133a組(miR-133a mimics轉(zhuǎn)染至子宮肌瘤細(xì)胞)。后續(xù)研究為驗(yàn)證PA是否通過調(diào)控miR-133a的表達(dá)而發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)分為PA+anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至子宮肌瘤細(xì)胞48 h，含有40 μg/ml PA的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)、PA+anti-miR-133a組(anti-miR-133a轉(zhuǎn)染至子宮肌瘤細(xì)胞48 h，含有40 μg/ml PA的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h)。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期子宮肌瘤細(xì)胞接種于96孔板(1.0×104個(gè)/孔)，棄上清液，按照“1.2.2”藥物處理方法進(jìn)行分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl(質(zhì)量濃度為5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，微量振蕩器中持續(xù)振蕩10 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD值)，細(xì)胞存活率(%)=(各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組子宮肌瘤細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS，4℃下1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平 采用Trizol法提取子宮肌瘤細(xì)胞RNA，應(yīng)用Nanodrop 2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，RNA OD260/OD280值處于1.8～2.0，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-133a正向引物5′-TTTGGTCCCCTT-CAAC-3′，反向引物：5′-TAGCTATCCTTTGCT-3′；U6正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。PCR擴(kuò)增：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-133a以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-133a相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測(cè)CyclinD1、EGFR、C-caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組子宮肌瘤細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入CyclinD1(1∶1 000)、EGFR(1∶1 000)、C-caspase-3(1∶500)一抗，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL化學(xué)發(fā)光劑，暗室內(nèi)曝光顯影，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.7ELISA法檢測(cè)EGF水平 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中EGF水平。

2 結(jié)果

2.1不同濃度PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，PA 10 μg/ml組、PA 20 μg/ml組、PA 40 μg/ml組、PA 80 μg/ml組子宮肌瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)，其中PA 40 μg/ml組細(xì)胞存活率為50%左右，因而選用PA 40 μg/ml作為后續(xù)研究，見圖1。

2.2PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和EGF的影響 相對(duì)于NC組，PA組子宮肌瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而EGF水平顯著降低(P<0.05)，見圖2。

2.3PA對(duì)miR-133a表達(dá)的影響 與NC組比較，PA組子宮肌瘤細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

2.4高表達(dá)miR-133a對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-133a組子宮肌瘤細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-133a的表達(dá)上調(diào)成功。相對(duì)于miR-NC組，miR-133a組子宮肌瘤細(xì)胞的細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，EGF水平顯著降低(P<0.05)，見圖4。

圖1 不同濃度PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of PA on proliferation of uterine fibroid cellsNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

圖2 PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和EGF的影響Fig.2 Effect of PA on uterine fibroid cell apoptosis and EGFNote:A.Detection of apoptosis by flow cytometry;B,C.Western blot detection of C-caspase-3 and EGFR protein expression；D.Detection level of EGF；compared with NC group,*.P<0.05.

圖3 PA對(duì)miR-133a表達(dá)的影響Fig.3 Effect of PA on the expression of miR-133aNote:Compared with NC group,*.P<0.05.

2.5低表達(dá)miR-133a可部分逆轉(zhuǎn)PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響 與PA+anti-miR-NC組比較，PA+anti-miR-133a組子宮肌瘤細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、EGFR蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而C-caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，EGF水平顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖4 高表達(dá)miR-133a對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響Fig.4 Effect of overexpressing miR-133a on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with miR-NC group,*.P<0.05.

圖5 低表達(dá)miR-133a可部分逆轉(zhuǎn)PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響Fig.5 Low expression of miR-133a can partially reverse PA′s effects on uterine fibroid cell proliferation,apoptosis and EGFNote:A.qRT-PCR detection of miR-133a expression level；B.Cell survival rate detected by MTT；C.Detection of apoptosis by flow cytometry;D，E.Western blot for CyclinD1,C-caspase-3,and EGFR protein expression；F.EGF level.Compared with PA +anti-miR-NC group,*.P<0.05.

3 討論

子宮肌瘤已嚴(yán)重威脅女性身體健康，近年來，隨著生活節(jié)奏的加快，子宮肌瘤發(fā)病率逐年升高，目前主要采用藥物治療與手術(shù)治療，激素類藥物可通過調(diào)控內(nèi)分泌從而達(dá)到治療效果，但副作用較大[10-12]。因而尋找安全有效又可最大程度保留子宮的治療方法或治療藥物成為研究重點(diǎn)。本研究通過分析PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響，為臨床用藥奠定理論基礎(chǔ)。

PA具有抗腫瘤作用，研究表明PA可通過抑制磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白的磷酸化從而抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，或通過抑制蛋白激酶B(Akt)的表達(dá)而抑制膽囊癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,以及通過抑制Wnt信號(hào)通路激活而抑制腎癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-15]。但PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚未可知。本研究結(jié)果顯示不同濃度的PA處理子宮肌瘤細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，提示PA可抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖。有研究表明C-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高可促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示PA可促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡，提高C-caspase-3蛋白表達(dá)水平，提示PA可能通過上調(diào)C-caspase-3的表達(dá)而誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤環(huán)境中巨噬細(xì)胞可被誘導(dǎo)為M2型巨噬細(xì)胞(TAM)，研究表明TAM可促進(jìn)EGF的生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，EGF可激活EGFR從而促進(jìn)腫瘤惡性增殖、血管生成及細(xì)胞遷移等過程[17-19]。本研究結(jié)果顯示PA可降低EGF、EGFR的表達(dá)水平，提示PA可能通過抑制EGF生成從而降低EGFR的表達(dá)水平進(jìn)而抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

miR-133a在腫瘤中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-133a的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[20]。研究表明姜黃素可通過上調(diào)miR-133a的表達(dá)從而抑制肝癌細(xì)胞遷移及侵襲[21]。本研究結(jié)果顯示PA處理后，子宮肌瘤細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平顯著升高，提示PA可能通過促進(jìn)miR-133a的表達(dá)從而抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究結(jié)果顯示miR-133a過表達(dá)后子宮肌瘤細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、EGFR、EGF表達(dá)水平均顯著降低，C-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高。研究表明CyclinD1可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖[22]。本研究結(jié)果顯示miR-133a過表達(dá)可調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)，影響EGF水平，抑制miR-133a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PA對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡及EGF的影響。

綜上所述，PA可通過上調(diào)miR-133a的表達(dá)從而減弱子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制EGF表達(dá)，因此，PA可能成為子宮肌瘤潛在治療藥物。