武少賢 蔣敬庭 (蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術(shù)研究中心，蘇州大學(xué)細胞治療研究院,常州 213003)

嵌合型抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)是經(jīng)過基因工程改造的T細胞，可以激活對腫瘤特異性抗原的免疫應(yīng)答。腫瘤通過破壞TCR活性來逃避腫瘤殺傷，但CAR采用了一種靶向方法，從而“避免了逃避機制”，使腫瘤再次易受T細胞介導(dǎo)的攻擊。CAR-T細胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤治療方面已顯示出顯著效果。特別是在急性淋巴細胞白血病(ALL)中有較高的抗腫瘤效應(yīng)[1]。然而，CAR-T細胞療法在實體腫瘤中療效欠佳。在腫瘤進展過程中，腫瘤細胞會改變正常的發(fā)育過程，形成抑制性的腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)，其中包括免疫細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞以及多種抑制分子[2]。從最早的浸潤前病變形成到轉(zhuǎn)移擴散，TME可以支持血管生成、腫瘤進展和免疫逃逸，并決定對腫瘤治療的反應(yīng)。盡管實體腫瘤中的腫瘤反應(yīng)性T淋巴細胞面臨各種各樣的困難，但越來越多的證據(jù)表明，對癌癥患者的自體免疫系統(tǒng)進行誘導(dǎo)和工程改造可以顯著改變臨床療效，特別是在黑色素瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中[3]。對TME復(fù)雜成分與免疫功能之間關(guān)系的研究將為CAR-T細胞療法攻克實體腫瘤提供新的依據(jù)。

1 CAR-T細胞的結(jié)構(gòu)及優(yōu)化設(shè)計

CAR由胞外、跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞外結(jié)構(gòu)域由衍生自抗體輕鏈和重鏈區(qū)的單鏈可變片段(scFv)組成，不需MHC分子參與即可與特定的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)結(jié)合?？缒らg隔子也稱為鉸鏈結(jié)構(gòu)域，由CD8和IgG4分子組成，起到連接胞內(nèi)和胞外的作用。細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域也稱為激活或信號結(jié)構(gòu)域，由CD3ζ組成。基于細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，CAR受體具有4代。CD3ζ在第一代中只是細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生的治療反應(yīng)有限[4]。為增強T細胞的活化、增殖和持久性，添加了其他共刺激分子，如CD27、CD28、4-1BB或OX-40。第二代由一個共刺激分子組成，第三代由兩個共刺激分子組成。除了CD3ζ和共刺激分子外，第四代還增加了抗腫瘤細胞因子基因(IL-12、IL-15)，從而增強了CAR-T細胞的抗腫瘤作用[5,6]。

目前，CAR-T的臨床研究主要集中在以CD19為靶點的血液系統(tǒng)腫瘤中，包括非霍奇金淋巴瘤以及急性B淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphocytic leukemia,B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia,CLL)[7]。CD19靶抗原僅在B細胞上表達，因此為CAR-T細胞治療提供了良好的靶點。然而，實體瘤缺乏合適的腫瘤相關(guān)抗原且具有異質(zhì)性，即常用的靶標通常在腫瘤細胞上過表達，但在非惡性組織上也低表達，這意味著正常組織也可能受到攻擊。目前，已經(jīng)開發(fā)三類雙特異性CAR來解決此類問題，即雙重CAR[8]、串聯(lián)CAR(Tan CAR)[9]和抑制性CAR(iCAR)[10]，當腫瘤細胞表面同時存在兩種靶抗原時，該類型CAR-T細胞才能被激活，顯著增強特異性，從而使旁觀者細胞不受影響。如Feng等[11]在晚期膽管癌患者中連續(xù)輸注抗EGFR和抗CD133 CAR-T細胞，導(dǎo)致抗腫瘤功效增強。此外，Roybal等[12]利用syn Notch(synthetic Notch)對雙重CAR進行了升級，該類型CAR與第一種抗原結(jié)合，然后通過合成的Notch受體響應(yīng)于指定抗原的識別而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活，可以調(diào)節(jié)CAR-T細胞的活性。最近，Cho等[13]開發(fā)了一種分離、通用、可編程式(split,universal and programmable,SUPRA)CAR，將T細胞與抗體分離，增強了T細胞轉(zhuǎn)換追蹤目標的能力，該種CAR必須同時識別腫瘤細胞上的兩個靶點才能激活，降低了CAR-T帶來的毒副作用。

2 腫瘤微環(huán)境對CAR-T治療的影響

2.1血管障礙 從最早的浸潤前病變形成到轉(zhuǎn)移擴散，TME可以支持血管生成，血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要標志[14]。脈管系統(tǒng)與正常血管相比具有異常的結(jié)構(gòu)和功能特性，異常脈管系統(tǒng)的形成導(dǎo)致支持腫瘤生長的低氧和酸性環(huán)境的產(chǎn)生。血管生成需要癌癥相關(guān)的成纖維細胞(CAF)和多種生長因子的調(diào)控，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)等。VEGF在內(nèi)皮細胞中表達，低氧和酸性環(huán)境有助于血管生成，被認為是惡性腫瘤的主要血管生成因子[15]。這些血管屏障導(dǎo)致CAR-T細胞很難進入腫瘤內(nèi)部。

2.2基質(zhì)障礙 TME的基質(zhì)屏障由結(jié)締組織形成，對免疫系統(tǒng)重塑以及腫瘤的生物學(xué)行為具有重要影響。胞外基質(zhì)(ECM)包含多種成分，包括膠原蛋白、蛋白聚糖、纖連蛋白、層黏連蛋白等。在實體瘤中，膠原蛋白和纖連蛋白提供細胞結(jié)構(gòu)支撐，而蛋白聚糖則有助于生長因子和細胞因子結(jié)合特性[16]。然而有研究報道ECM中的非結(jié)構(gòu)性基質(zhì)蛋白，如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，能夠促進腫瘤細胞的增殖與遷移[17]。因此需要增加CAR-T細胞降解富含基質(zhì)的ECM的能力。

2.3免疫抑制細胞及其分泌的細胞因子 調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)通過其抑制功能來防止由于過度或不必要的免疫激活而導(dǎo)致的自身免疫和組織損傷，在維持自我耐受和免疫穩(wěn)態(tài)中具有重要作用[18]。然而，在腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞通過其高親和力IL-2受體從周圍攝取IL-2，使其無法用于反應(yīng)性T細胞。它們還組成性表達細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)，下調(diào)抗原呈遞細胞(APC)的CD80/CD86表達，從而抑制反應(yīng)性T細胞的活化。Treg細胞還產(chǎn)生免疫抑制性細胞因子，例如IL-10，也可下調(diào)APC功能。這種IL-2/IL-2受體依賴性和CTLA-4依賴性機制是Treg介導(dǎo)的包括腫瘤在內(nèi)的各種組織抑制作用的核心基礎(chǔ)[19]。

骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)起源于骨髓生成過程中骨髓(也包括小鼠脾臟)的普通髓樣祖細胞(CMP)。MDSC有兩種亞型：單核(M-MDSC)和多形核或粒細胞MDSC(PMN-MDSC)。MDSC由骨髓經(jīng)血液循環(huán)，流向炎癥部位和實體瘤。在TME的炎性環(huán)境中，多種因素促進MDSC抑制活性[20]。在外周淋巴器官中，PMN-MDSC會保留大量的各種活性氧(ROS)，并會導(dǎo)致抗原特異性T細胞抑制/耐受。M-MDSC產(chǎn)生大量不同的因子，可使自身細胞抑制抗原特異性和非特異性T細胞應(yīng)答，M-MDSC維持STAT3的高活性，阻止了他們向樹突狀細胞(DC)或巨噬細胞的快速分化。

在TME中由于缺氧的影響，MDSC中的STAT3活性大大降低。這導(dǎo)致M-MDSC快速分化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor associated macrophages,TAM)。PMN-MDSC中的ROS水平顯著降低，但精氨酸酶1(ARG1)的上調(diào)和其他引起非特異性T細胞抑制的因素增加。M-MDSC也會發(fā)生同樣的情況。同時垂死的MDSC細胞釋放的因子可以促進免疫抑制機制[21]。自然殺傷(NK)細胞是從骨髓中常見的淋巴祖細胞發(fā)育而來的固有淋巴細胞，是抵抗外來病原體感染和清除惡變細胞的第一道防線。然而Bruno等[22]指出NK細胞在子宮脈管系統(tǒng)中具有重要的促血管生成作用，NK細胞介導(dǎo)的腫瘤免疫監(jiān)視所需的Stat5基因失活會上調(diào)NK細胞中的VEGFA并增強小鼠淋巴瘤模型中的血管生成[23]。

巨噬細胞被募集到與TME的基質(zhì)中，朝著與癌癥進展有關(guān)的M2巨噬細胞極化。TAM通過產(chǎn)生生長因子(如EGF、VEGF)來維持腫瘤的生長，通過釋放蛋白酶(例如組織蛋白酶、MMP-2、MMP-9)和可溶性介質(zhì)(例如TGF-β、IL-37)來促進胞外基質(zhì)的重塑。通過釋放MMP-9或其他可溶性因子(例如VEGF、PDGF、胸苷磷酸化酶、CXCL8)促進血管生成和淋巴管生成，并通過釋放可溶性介質(zhì)(如IL-10、IDO、TGF-β)抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答[24]。除此之外，腫瘤相關(guān)的中性粒細胞(tumor associated neutrophils,TAN)在腫瘤的生長和進展中也展現(xiàn)出雙重作用，TAN可以通過釋放ROS和中性粒細胞彈性蛋白酶來介導(dǎo)腫瘤細胞殺傷，通過釋放ROS抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，并在抑制TGF-β后增強抗腫瘤T細胞反應(yīng)。相反，TAN可通過釋放ROS促進遺傳不穩(wěn)定，通過彈性蛋白酶促進腫瘤細胞增殖，通過釋放VEGF、MMP-9或Bv8維持血管生成，通過可溶性介質(zhì)增強腫瘤細胞的侵襲性，通過表達由TGF-β驅(qū)動的精氨酸酶，有效地抑制抗腫瘤CD8+T細胞免疫反應(yīng)[24]。

2.4免疫抑制性分子 TME可以促進免疫抑制受體在T細胞上的表達，如淋巴細胞激活蛋白3(LAG-3)、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白分子3(TIM-3)、CTLA-4、程序性死亡受體1(PD-1)等。CTLA-4主要在輔助T細胞和Treg細胞上表達，是CD28的同源物。當CTLA-4與APC上的配體B7分子結(jié)合后導(dǎo)致T細胞活化受到抑制。因此，CTLA-4阻斷可以放大針對腫瘤的T細胞反應(yīng)[25]。PD-1是另一個關(guān)鍵的免疫檢查點受體，作為T細胞功能的負調(diào)節(jié)劑，其表達比CTLA-4廣泛。TME中活化的CD8+T細胞和Treg以及非淋巴細胞均可誘導(dǎo)PD-1的表達。其作用機制是和腫瘤細胞表面的PD-L1結(jié)合后抑制T細胞的活化和增殖，促進腫瘤發(fā)生免疫逃逸[26]。因此，PD-1抗體和CTLA-4抗體的聯(lián)合使用成為抗腫瘤的有效治療方法[27,28]。目前針對這些檢查點開展了一系列臨床試驗[29]。除此之外，TME中氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)不足，缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)誘導(dǎo)各種促血管生成基因的表達。并且在低氧條件下，腫瘤細胞消耗葡萄糖并分泌乳酸，產(chǎn)生酸性腫瘤微環(huán)境[15]。同時，腫瘤也會分泌一些趨化因子，如CXCL12和CXCL15，不利于T細胞浸潤到腫瘤部位[30](圖1)。

3 實體瘤腫瘤微環(huán)境的CAR-T細胞治療策略

3.1增強CAR-T細胞向?qū)嶓w瘤部位的運輸 CAR-T細胞治療在實體瘤中效果不佳的一個因素就是其向腫瘤部位運輸?shù)牡托?。在血液腫瘤中，輸注CAR-T細胞之后可以直接殺傷在血液中的腫瘤細胞。因此Brown等[31]采用局部遞送的方法將CAR-T細胞顱內(nèi)遞送至3例復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤患者切除腔中，有兩名患者在切除切緣未見腫瘤復(fù)發(fā)。接著Brown等[32]對一名患有復(fù)發(fā)性多灶性膠質(zhì)母細胞瘤的患者通過兩條途徑(鼻腔內(nèi)和腦室內(nèi))遞送靶向與腫瘤相關(guān)的抗原白介素13受體α2(IL13Rα2)CAR-T細胞，與腔內(nèi)相比，腦室內(nèi)途徑在控制遠期復(fù)發(fā)方面具有更好的反應(yīng)。在一項臨床前試驗中Murad等[33]構(gòu)建了靶向腫瘤相關(guān)糖蛋白72(TAG72)的CAR-T細胞，通過向卵巢腫瘤異種移植模型中腹膜內(nèi)遞送該種CAR-T細胞能夠顯著延緩腫瘤生長，提高了小鼠的整體存活率。在一項Ⅰ期臨床試驗中，Katz等[34]在具有肝轉(zhuǎn)移的大腸癌中，通過肝動脈局部輸注靶向CEA的CAR-T細胞療法已顯示出顯著效果。

圖1 CAR-T細胞治療與腫瘤微環(huán)境Fig.1 CAR-T cell therapy and tumor microenvironmentNote:A.CAR-T cell bind to tumor antigens through CAR receptors to produce antitumor effects;B.The solid tumor tumor microenviron-ment consists of a complex vasculature,matrix barrier,and a variety of immunosupp-ressive cells.At the same time,immuno-suppressive cells and tumor cells secrete various cytokines and chemokines.These factors make it difficult for T cells to infiltrate solid tumor tissues and inhibit the function of T cells.

T細胞會表達各種趨化因子受體來向腫瘤部位遷移，然而腫瘤細胞表達的趨化因子往往與其不匹配，限制了CAR-T細胞向腫瘤部位的運輸。Whilding等[35]在靶向腫瘤相關(guān)αvβ6整聯(lián)蛋白的CAR-T細胞中共表達了其同源受體(CXCR1或CXCR2)。結(jié)果顯示，表達CXCR2的CAR-T細胞顯示出針對已建立的表達αvβ6的卵巢或胰腺腫瘤異種移植物的優(yōu)異的抗腫瘤活性。在神經(jīng)母細胞瘤中，利用其產(chǎn)生趨化因子CCL2，設(shè)計了針對靶向GD2的CAR-T細胞，通過強制共表達趨化因子受體CCR2b可以增強這種作用，因為該受體指導(dǎo)向CCL2的遷移，并且在小鼠模型中證實該種CAR-T細胞具有較好的歸巢能力及抗腫瘤效應(yīng)[36]。此外，T細胞區(qū)成纖維網(wǎng)狀細胞產(chǎn)生的IL-7和CCL19對于淋巴器官中T細胞區(qū)的形成和維持至關(guān)重要，因此Adachi等[37]構(gòu)建了能夠產(chǎn)生IL-7和CCL19的CAR-T細胞，能夠?qū)細胞和DC募集到腫瘤微環(huán)境中，增強了CAR-T細胞的抗腫瘤作用。

3.2中和腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制介質(zhì) 當CAR-T細胞進入實體瘤后，會受到各種抑制性分子的影響，通過改造CAR的結(jié)構(gòu)，使其產(chǎn)生能夠重塑TME的分子，增強對實體瘤的抗腫瘤作用。通過將CAR-T細胞與免疫檢查點封鎖抑制劑聯(lián)合使用，可增強CAR-T細胞療法對反應(yīng)不良腫瘤的療效。Rafiq等[38]構(gòu)建了能夠分泌PD-1阻斷單鏈可變片段(scFv)的CAR-T細胞，起到與CAR-T細胞和檢查點抑制劑聯(lián)合治療所達到的效果。這種方法保護CAR-T細胞免受PD-1抑制，從而可以避免與系統(tǒng)檢查點抑制相關(guān)的毒性。TGF-β是上皮細胞中重要的調(diào)節(jié)性腫瘤抑制因子，它在早期抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡。然而，腫瘤細胞發(fā)展出克服TGF-β誘導(dǎo)的抑制作用的機制。一旦發(fā)生這種情況，細胞可能會對這種細胞因子產(chǎn)生反應(yīng)，從而誘導(dǎo)其他有助于腫瘤進展的作用[39]。Zhang等[40]在前列腺癌中構(gòu)建了前列腺特異性膜抗原(PSMA)特異和對免疫抑制劑分子TGF-β不敏感的CAR-T細胞，可抵抗TGF-β介導(dǎo)的細胞毒性T細胞功能的抑制。在小鼠異種移植模型中發(fā)現(xiàn)輸入該種CAR-T細胞的小鼠腫瘤得到顯著抑制，并且小鼠的血清IFN-γ和IL-2水平升高，表明其激活了機體抗腫瘤免疫力。

除此之外，還可以利用CAR-T細胞作為生產(chǎn)媒介物將促炎細胞因子(比如IL-12、IL-15、IL-18)分泌到腫瘤組織中，增強T細胞的效應(yīng)能力。Hu等[41]構(gòu)建了兩種分泌IL-18的CAR，體外實驗均證實IL-18可以增強靶向CD19和靶向MSLN的CAR-T細胞增殖，增強了靶向CD19的CAR-T細胞小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性。在神經(jīng)母細胞瘤中，Chen等[42]優(yōu)化了靶向GD2的CAR-T細胞，使其分泌IL-15，結(jié)果顯示產(chǎn)生IL-15的GD2 CAR-T細胞在體外反復(fù)暴露于腫瘤細胞后具有增強的細胞毒活性，并產(chǎn)生Th1細胞因子，同時降低CAR-T細胞表面PD-1的表達，在異種神經(jīng)母細胞瘤小鼠模型中顯著抑制腫瘤生長。同樣在卵巢癌中，Yeku等[43]設(shè)計了一種能夠組成性分泌IL-12的靶向Muc16的CAR-T細胞，在腹水微環(huán)境中增殖更好，保留細胞毒性并抵抗凋亡。該種CAR-T細胞能夠介導(dǎo)TAM細胞耗竭和抵抗內(nèi)源性PD-L1誘導(dǎo)的抑制作用。在卵巢腹膜癌的同基因模型中提高了小鼠生存率。這些發(fā)現(xiàn)顯示了抑制性微環(huán)境的作用以及如何進一步改造CAR-T細胞以維持功效。

表1 針對實體瘤腫瘤微環(huán)境開展的CAR-T臨床前和臨床研究

Tab.1 CAR-T preclinical and clinical studies on solid tumor microenvironment

Malignancy typeTarget antigenCAR signalingIdentifierReferenceCholangiocarcinomaEGFR-CD1334-1BB-CD3NCT01869166 NCT02541370[11]GlioblastomaIL13Rα24-1BB-CD3NCT02208362[32]Ovarian cancerTAG724-1BB-CD3[33]Hepatic carcinomaCEACD28-CD3NCT01373047[34]Pancreatic cancerαvβ6CD28-CD3[35]NeuroblastomaGD2CD28-OX-40-CD3[36]Ovarian cancerMuc16CD28-CD3[38]Prostate cancerPSMACD3[40]NeuroblastomaGD2CD28-CD3[42]Malignant pleural mesotheliomaCAFCD28-CD3[44]

3.3增強腫瘤微環(huán)境中CAR-T細胞療效的其他方法 癌癥相關(guān)的成纖維細胞(CAF)促進血管生成，有助于實體瘤的進展和轉(zhuǎn)移，因此Schuberth等[44]構(gòu)建了靶向成纖維細胞活化蛋白(FAP)的CAR-T細胞，在體外以抗原特異性方式裂解FAP陽性間皮瘤細胞和炎性成纖維細胞，并且抑制了FAP陽性人類間皮瘤細胞在小鼠腹膜腔的生長，并顯著延長了小鼠的生存期。此外，T細胞代謝途徑的修飾也為抵消免疫抑制性TME提供另一種思路。T細胞的活化增殖以及發(fā)揮效應(yīng)功能需要糖酵解提供能量，然而腫瘤細胞擴張需要更多的能量，對T細胞的有效活化具有競爭性抑制作用?？梢酝ㄟ^在體外培養(yǎng)時限制糖酵解代謝來保留其抗腫瘤活性，如外源精氨酸補充體外培養(yǎng)基抑制T細胞糖酵解代謝，同時促進氧化途徑，導(dǎo)致體內(nèi)細胞持久性和抗腫瘤活性增加(表1)[45,46]。

4 展望

CAR-T細胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中已經(jīng)展示了令人滿意的臨床效果，但針對實體瘤的CAR-T細胞療效欠佳。主要原因在于實體瘤具有復(fù)雜的免疫抑制微環(huán)境，限制了CAR-T細胞的運輸并降低了其活性。近年來，開發(fā)新方法來破解實體瘤引起的障礙，并針對這些特定適應(yīng)癥優(yōu)化CAR-T細胞治療，包括尋找新的腫瘤特異性抗原和CAR-T在腫瘤部位的浸潤，中和或調(diào)節(jié)免疫抑制性TME，優(yōu)化CAR-T功能減輕潛在的毒性等，在一定程度上揭示了CAR-T細胞治療在實體瘤中的作用機理，使實體瘤的治療取得較好療效，也為腫瘤患者帶來福音。