梁紅鎖 李林 梁輝

激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是一種常見(jiàn)的骨科難治性疾病，好發(fā)于青壯年，如未進(jìn)行有效干預(yù)則難以自愈，而且隨著病情進(jìn)展，患髖疼痛進(jìn)一步加劇，逐漸出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)功能障礙，最終股骨頭塌陷、變扁，引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響患者的生活和工作。因此早期發(fā)現(xiàn)并予以及時(shí)、有效的治療是SONFH 診治的基本原則。目前臨床上藥物治療早期SONFH 以抗凝、擴(kuò)張血管、二磷酸鹽、降脂類(lèi)藥物為主[1，2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物除具有傳統(tǒng)的降脂作用外，其他作用如抗骨質(zhì)疏松、促骨形成等使其成為近年來(lái)骨科新的研究方向[3，4]?，F(xiàn)已有口服他汀類(lèi)藥物可有效治療SONFH 的實(shí)驗(yàn)研究[5～7]，但尚未見(jiàn)其局部應(yīng)用干預(yù)SONFH 的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在激素性壞死股骨頭內(nèi)局部應(yīng)用普伐他汀，以觀察其促進(jìn)骨壞死修復(fù)的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物45 只成年健康SPF 級(jí)新西蘭白兔，體重（2.5±0.5）kg，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有動(dòng)物均處一室，分籠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，通風(fēng)良好，溫度控制在22℃～ 26℃，濕度50%左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后造模。

1.2 造模方法所有動(dòng)物于造模前再次稱重，參照秦嶺等[8]造模方法，經(jīng)兔耳緣靜脈注射10μg/kg 的內(nèi)毒素（lippolysaccharide，LPS，美國(guó)Sigma 公司），并于24h 后進(jìn)行甲強(qiáng)龍（methylprednisolone，MPS，美國(guó)輝瑞制藥公司）臀部肌肉注射，劑量為20mg/kg。MPS 每次間隔24h 臀部肌肉注射，共3 次。造模6周后，將動(dòng)物以隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組，每組15 只。A 組（模型組）：自由進(jìn)食，未實(shí)施其他干預(yù)措施。B組（髓芯減壓組）：雙側(cè)股骨頭予以髓芯減壓，并于減壓通道內(nèi)植入無(wú)菌明膠海綿。C 組（普伐他汀局部用藥組）：雙側(cè)股骨頭髓芯減壓后，于減壓通道內(nèi)植入含10mg 普伐他汀的無(wú)菌明膠海綿（其中普伐他汀予以鈷60 輻照滅菌）。兔髓芯減壓方法參照本課題組前期研究[9]。分別于股骨頭髓芯減壓術(shù)后第4、8、12 周，每組各處死5 只白兔，取其左側(cè)股骨頭標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)研究，右側(cè)行相關(guān)分子生物學(xué)檢測(cè)（另文發(fā)表）。

1.3 病理學(xué)觀察

1.3.1 大體觀察 將兔股骨頭從冠狀面正中剖開(kāi)，主要觀察股骨頭的顏色、外形、軟骨厚度、骨髓腔各組織成分的改變、骨小梁密度等。

1.3.2 HE 染色 股骨頭以10%甲醛溶液固定24h后，5%硝酸脫鈣，系列梯度酒精脫水，石蠟包埋后進(jìn)行切片，厚度為5μm。HE 染色，顯微鏡下觀察軟骨、軟骨下骨、骨髓腔內(nèi)骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨小梁等結(jié)構(gòu)。光鏡下任選5 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)20～30 個(gè)骨細(xì)胞，計(jì)算空骨陷窩率，取其平均值作為該股骨頭的空骨陷窩率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察A 組：術(shù)后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面為暗紅色，股骨頭切面內(nèi)骨皮質(zhì)變薄，髓腔內(nèi)可見(jiàn)無(wú)定形壞死骨組織，有較多脂肪組織沉積。術(shù)后第8 周，股骨頭骨質(zhì)較松脆，易于剖切，髓腔內(nèi)壞死面積增大，脂肪組織較前增多。術(shù)后第12 周，股骨頭外形正常，股骨頭內(nèi)壞死面積較前稍減小，壞死組織周?chē)猩倭啃鹿切纬伞 組：術(shù)后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面顏色稍暗，略呈灰白色，股骨頭骨皮質(zhì)變薄，髓腔內(nèi)可見(jiàn)壞死骨組織，伴少量脂肪組織增生。術(shù)后第8 周，股骨頭內(nèi)壞死面積稍增大，脂肪組織較前增多。術(shù)后第12 周，股骨頭外形正常，骨壞死面積較前減小，壞死骨組織周?chē)休^多新骨形成。C 組：術(shù)后第4 周，股骨頭外形正常，軟骨面顏色略暗，稍呈灰白色。股骨頭骨皮質(zhì)變薄，髓腔內(nèi)可見(jiàn)骨壞死，伴少量脂肪組織增生。術(shù)后第8 周，軟骨面呈淡紅色，股骨頭內(nèi)壞死面積較前減小，有少量新生骨組織形成。術(shù)后第12 周，股骨頭外形正常，股骨頭內(nèi)壞死面積較前明顯減少，壞死組織周?chē)写罅啃鹿切纬伞?/p>

2.2 光鏡觀察A 組：術(shù)后第4 周，股骨頭內(nèi)有大量脂肪細(xì)胞增生，骨小梁變細(xì)、排列稀疏，骨細(xì)胞核邊聚，空骨陷窩數(shù)較多。術(shù)后第8 周，股骨頭骨髓腔內(nèi)壞死區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，部分纖維肉芽組織形成，骨小梁斷裂、稀疏，骨細(xì)胞核邊聚明顯，空骨陷窩進(jìn)一步增多。術(shù)后第12 周，壞死股骨頭內(nèi)骨小梁周?chē)梢?jiàn)少量新生骨組織，空骨陷窩數(shù)稍減少（見(jiàn)圖1A）。B 組：術(shù)后第4 周，股骨頭內(nèi)有較多壞死組織，大量脂肪細(xì)胞增生，骨小梁排列稀疏，骨細(xì)胞核邊聚較明顯，有較多空骨陷窩。術(shù)后第8 周，股骨頭骨髓腔內(nèi)壞死區(qū)結(jié)構(gòu)紊亂，部分骨小梁斷裂，空骨陷窩增多。術(shù)后第12 周，斷裂骨小梁周?chē)梢?jiàn)少量新生骨組織形成，空骨陷窩數(shù)較前減少（見(jiàn)圖1B）。C組：術(shù)后第4 周，股骨頭內(nèi)有中等量脂肪細(xì)胞增生，骨小梁稍稀疏，部分骨小梁斷裂，可見(jiàn)較多空骨陷窩。術(shù)后第8 周，股骨頭內(nèi)有少量脂肪細(xì)胞，骨小梁周?chē)休^多新生骨組織及血管形成，空骨陷窩減少。術(shù)后第12 周，骨小梁密度基本正常，偶見(jiàn)空骨陷窩（見(jiàn)圖1C）。

圖1 各組術(shù)后第12 周光鏡觀察（HE，200×）

2.3 各組造模后空骨陷窩率比較B、C 兩組空骨陷窩率均較A 組低（P＜0.05）。C 組空骨陷窩率低于B組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)后第4、8、12 周空骨陷窩率比較（%，±s，n=5）

表1 各組術(shù)后第4、8、12 周空骨陷窩率比較（%，±s，n=5）

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，△P＜0.05

分組 第4 周 第8 周 第12 周A 組 30.29±3.83 32.85±2.32 26.71±2.43 B 組 23.14±2.65* 27.09±1.93* 19.87±1.99*C 組 16.23±1.94*△ 13.83±1.17*△ 10.58±1.87*△

3 討論

研究表明激素可促使骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致股骨頭單位體積內(nèi)骨細(xì)胞數(shù)量下降[10]。長(zhǎng)期應(yīng)用激素導(dǎo)致股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)目減少，引起骨質(zhì)疏松，骨組織機(jī)械應(yīng)力隨之減弱，在輕微的外力作用下即可發(fā)生骨小梁微細(xì)骨折[11]。與此同時(shí)，由于激素可引起骨內(nèi)微循環(huán)障礙、誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）向脂肪細(xì)胞分化等多種因素，應(yīng)力引發(fā)的軟骨下微骨折得不到及時(shí)修復(fù)，最終出現(xiàn)股骨頭骨壞死、塌陷。核心結(jié)合因子（core binding factor a1，Cbfa1）是成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的特異性轉(zhuǎn)錄因子，BMP-2 可促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化[12]。有研究表明，普伐他汀灌胃能上調(diào)兔激素性壞死股骨頭內(nèi)Cbfa1 及BMP-2 mRNA 的表達(dá)，且隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，二者的表達(dá)水平逐步升高[13]。胡敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與兔SONFH 模型組的股骨頭髓腔內(nèi)大量脂肪細(xì)胞增生及壞死骨組織相比，普伐他汀灌胃治療組內(nèi)骨細(xì)胞受損程度較輕，空骨陷窩數(shù)較少，脂肪細(xì)胞數(shù)量減少及骨壞死面積均明顯減小，表明普伐他汀口服可有效促進(jìn)激素性壞死股骨頭的修復(fù)。

目前在他汀類(lèi)藥物促骨形成的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，多采用口服給藥。他汀類(lèi)藥物口服后經(jīng)過(guò)肝臟的首過(guò)效應(yīng)，進(jìn)入血液循環(huán)的藥物濃度不足5%，進(jìn)入骨組織的藥物濃度則更低[15]。由于口服給藥往往療程較長(zhǎng)，患者的依從性會(huì)受到較大影響。通過(guò)改變此類(lèi)藥物的給藥途徑來(lái)提高其生物利用度值得探究。劉屹嵩等[16]將兔下頜骨骨折區(qū)覆蓋含辛伐他汀的明膠海綿作為實(shí)驗(yàn)組，與單純覆蓋明膠海綿的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后第2、4 周的BMP-2 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，骨痂形成與改建速度優(yōu)于對(duì)照組。李楊等[17]將辛伐他汀局部注入去勢(shì)大鼠的股骨髓腔，給藥1 個(gè)月后，辛伐他汀治療組的骨皮質(zhì)厚度、骨小梁密度等明顯優(yōu)于對(duì)照組，表明辛伐他汀局部應(yīng)用可促進(jìn)骨小梁改建、強(qiáng)化局部骨質(zhì)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，普伐他汀局部應(yīng)用可上調(diào)兔激素性壞死股骨頭內(nèi)BMP-2 mRNA 的表達(dá)[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，壞死股骨頭內(nèi)局部應(yīng)用普伐他汀后有明顯新生骨組織形成，骨小梁密度基本恢復(fù)正常，單位面積內(nèi)空骨陷窩率降低，與同期其他兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明普伐他汀局部用藥可促進(jìn)激素性壞死股骨頭的修復(fù)，有望為SONFH 的臨床治療提供一種新的方法。