張宇 楊帆

隨著社會進步與人們生活水平提高，心血管疾病的發(fā)病率日趨增高并逐步年輕化[1]，心血管疾病研究一直是科研工作者不斷探索及關(guān)注的領(lǐng)域。在分子醫(yī)學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)快速發(fā)展的今天，乳鼠心肌細(xì)胞是目前心血管疾病研究與治療的主要對象，乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)則是進行心血管疾病研究的最基礎(chǔ)手段[2]。動物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，不利于進行細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因表達(dá)及細(xì)胞生理病理學(xué)特性等研究，故需要穩(wěn)定、有效的體外細(xì)胞培養(yǎng)模 型[3]。心肌細(xì)胞具有培養(yǎng)簡易方便，且實驗重復(fù)性好等優(yōu)點，被認(rèn)為是進行心臟基因測序及細(xì)胞學(xué)研究的有效對象，從而推進心臟疾病的治療進程[4]。成熟心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)難度較大，并且由于每個實驗室體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件與方法不一致[5，6]，導(dǎo)致原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的存活率、純度等有很大差異，不僅浪費人力物力，而且導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不穩(wěn)定與差異性大等問題，無法滿足實驗需求，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。本研究在傳統(tǒng)乳鼠心肌細(xì)胞原代分離、培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上進行改良，使乳鼠心肌細(xì)胞能夠成片狀生長，有利于心肌細(xì)胞生理、病理及毒理等的基礎(chǔ)實驗研究進展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生24h 內(nèi)的C57BL/6J 乳小鼠30只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗設(shè)備 生物安全柜（新加坡ESCO 公司），恒溫培養(yǎng)振蕩器（美國Thermo 公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），倒置相差光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司），倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.1.3 實驗試劑 Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DMEM）高糖型培養(yǎng)基（美國Corning 公司），胎牛血清（FBS，以色列BI 公司），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，美國Sigma 公司），明膠（美國Sigma 公司），0.25%胰蛋白酶（簡稱胰酶，杭州吉諾生物公司），Ⅱ型膠原酶（美國Thermo 公司），青霉素-鏈霉素溶液（簡稱雙抗，杭州吉諾生物公司），Troponin I 兔多克隆抗體（美國Abcam 公司），Dylight488 標(biāo)記羊抗兔IgG（美國Abcam 公司），TrionX-100（上海碧云天公司），牛血清白蛋白（BSA，美國AMRESCO公司），臺盼藍(lán)（北京索萊寶公司），無水乙醇（上海滬試），甲醛（上海滬試），磷酸鹽緩沖液（PBS，杭州吉諾生物公司）。

1.2 試劑配制

1.2.1 培養(yǎng)基A 含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS 及1%雙抗配制的DMEM 高糖型培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基B 含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、1%雙抗以及0.1mmol/L BrdU 配制的DMEM 高糖型培養(yǎng)基。

1.2.3 消化液 將0.1%胰酶與0.1%膠原酶Ⅱ型混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.3.1 取材 乳小鼠置于75%乙醇中消毒后，移入超凈工作臺，固定其四肢，用無菌眼科剪開胸并取出心臟，剪去心房及結(jié)締組織部分，僅留取左心室，放入預(yù)冷PBS 中反復(fù)清洗血液，并移入另一無菌玻璃皿中，將心室組織剪為1mm3組織塊，在冰上進行上述操作。

1.3.2 細(xì)胞消化 第一次消化心室組織：將剪碎后的心室組織移入50ml 離心管，加入10ml 消化液，放入37℃搖床100rpm，15min，棄掉上清，收集沉淀。第二次消化心室組織：將第一次消化后沉淀的心室組織中加入10ml 消化液，37℃搖床100rpm，10min，充分吹打后靜止，待未消化完全細(xì)胞沉淀后小心收集上清（避免吸入組織塊）置于20ml 培養(yǎng)液中。重復(fù)5～6次消化步驟，至完全消化為止，收集上清。用200μm篩網(wǎng)過濾，1 000rpm，4℃，離心8min，收集上清。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用培養(yǎng)基A 將收集到的細(xì)胞懸液再次重懸，接種于T25 培養(yǎng)瓶，放入5% CO2恒溫（37℃）細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5h（即差速貼壁分離法）。將T25 培養(yǎng)瓶中的上清液轉(zhuǎn)移至另一無菌T25 培養(yǎng)瓶，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，進行第二次差速貼壁。同時，在六孔板中鋪0.5%明膠，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h 備用。收集上清并計數(shù)后，離心1 000rpm，4℃，8min，棄上清，留取細(xì)胞沉淀。用培養(yǎng)基B 重懸細(xì)胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的細(xì)胞密度接種于包被0.5%明膠的六孔板中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。同時，取200μl 未接種的細(xì)胞懸液進行細(xì)胞存活率檢測。細(xì)胞培養(yǎng)24h 后給予培養(yǎng)基B 換液，前3 天每天使用培養(yǎng)基B 換液培養(yǎng)，以后使用培養(yǎng)基A（即不加BrdU）常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞純度及存活率檢測

1.4.1 光學(xué)顯微鏡 細(xì)胞培養(yǎng)24h 后，于倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 細(xì)胞免疫熒光染色及細(xì)胞純度鑒定 實驗前1d 將細(xì)胞消化后按照1.5×105/10cm2的細(xì)胞密度重新鋪于24 孔板中培養(yǎng)24h。次日，拿出細(xì)胞吸出培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次。用4%甲醛溶液固定10min，預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次；用0.2% TritonX-100 破膜10min，預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次。3% BSA 室溫封閉1h，預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次。加入Troponin I 兔多克隆抗體（一抗?jié)舛?∶400），放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育16～20h。次日，吸出一抗，預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次，加入Dylight488 標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體（二抗?jié)舛?∶400），室溫孵育1h，預(yù)冷PBS 輕柔清洗細(xì)胞3 次，在倒置熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞純度=熒光染色陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3 細(xì)胞存活率檢測 利用臺盼藍(lán)染色法評價細(xì)胞存活率，是目前常規(guī)的檢測方法。留取200μl 細(xì)胞懸液，加入等量0.4%臺盼藍(lán)染液，室溫染色2～ 3min。將染色后的細(xì)胞懸液涂于載玻片上，蓋玻片封片，于倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察。任意選取5個視野，統(tǒng)計被染色細(xì)胞（死細(xì)胞）和未被染色細(xì)胞（活細(xì)胞）。細(xì)胞存活率（%）=未被染色細(xì)胞/（被染色細(xì)胞+未被染色細(xì)胞）×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞純度檢測

2.1.1 光學(xué)顯微鏡 細(xì)胞培養(yǎng)24h 后，心肌細(xì)胞基本全部貼壁，伸出偽足，呈梭形、三角形或不規(guī)則形，核仁清楚（圖1A）。培養(yǎng)48h 后，細(xì)胞偽足逐漸增多，呈局部片狀。培養(yǎng)72h 后，大部分心肌細(xì)胞的突起相互交聯(lián)，形成片狀（圖1B）。

圖1 乳小鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞圖

2.1.2 細(xì)胞免疫熒光染色 培養(yǎng)24h 和培養(yǎng)72h 后，通過免疫熒光染色檢測貼壁心肌細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形、三角形或不規(guī)則形。培養(yǎng)24h 后，細(xì)胞呈簇狀或團狀分布（圖2A）；培養(yǎng)72h 后，細(xì)胞已相互連接，形成片狀（圖2B）。隨機選取5 個不同鏡下視野計算出心肌細(xì)胞純度為（95.30±1.36）%。

圖2 乳小鼠原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞熒光染色圖

2.2 細(xì)胞搏動頻率在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞培養(yǎng)24h 后有少數(shù)自發(fā)性搏動；培養(yǎng)48h 后出現(xiàn)局部片狀搏動，節(jié)律、頻率不等，收縮頻率為（99.33±5.13）次/min；培養(yǎng)第5 天，大部分心肌細(xì)胞呈同步收縮，收縮頻率為（100.67±6.43）次/min；培養(yǎng)第7 天、第9 天、第11 天，細(xì)胞仍保持均一搏動，收縮頻率分別為（104±10）次/min、（92.67±10.02）次/min、（97.00±9.17）次/min（圖3）。

2.3 細(xì)胞存活率通過臺盼藍(lán)染色法我們檢測出在培養(yǎng)第2 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11 天的細(xì)胞存活率分別為（95.33±2.51）%、（83.00±3.60）%、（63.33±3.51）%、（57.67±3.06）%、（48.67±3.21）%（圖4）。

圖3 乳小鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞搏動頻率

圖4 乳小鼠原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活率

3 討論

心血管疾病的基礎(chǔ)研究技術(shù)歷經(jīng)50年的發(fā)展，現(xiàn)今的電生理、鈣瞬變、蛋白質(zhì)組學(xué)及基因水平轉(zhuǎn)移等研究，對探索心肌細(xì)胞病理生理狀態(tài)的功能改變起到至關(guān)重要的推進作用[7]。心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)則是深入研究心血管疾病最基礎(chǔ)的手段[2]。體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞去除了體內(nèi)復(fù)雜的體液、神經(jīng)等因素的作用，尤其相較于心肌細(xì)胞株H9C2 更能有效反映心臟生理特性、信號傳導(dǎo)通路及基因表達(dá)等，是研究心血管生理、病理、毒理的常用細(xì)胞模型[4]。心肌細(xì)胞對物理、化學(xué)等損傷極為敏感，這將導(dǎo)致體外分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞產(chǎn)量和存活率低等問題。此外，心肌細(xì)胞占心臟組織的25%，其余心臟成分以成纖維細(xì)胞為主[8]，成纖維細(xì)胞分裂增殖能力強，更能成為體外培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)胞。因此，為了在體外培養(yǎng)出純度高、活性強的心肌細(xì)胞，我們根據(jù)實驗研究經(jīng)驗，在傳統(tǒng)的實驗技術(shù)方法上進行 改良。

在小鼠年齡選擇上，傳統(tǒng)的心肌細(xì)胞培養(yǎng)選用出生3 天的乳鼠[5]，認(rèn)為此時的心肌細(xì)胞增殖更快，但是由于出生時間短的小鼠心臟組織中膠原組織含量少，細(xì)胞消化過程省時省力，并且能減少對心肌細(xì)胞的損害，因此，我們選用出生24h 內(nèi)的小鼠進行實驗。在實驗操作的時間節(jié)點選擇上，傳統(tǒng)的實驗方法是差速貼壁1 次，時間為1.5h[2，8]，但是我們發(fā)現(xiàn)，在第1 次差速貼壁后的上清液中仍有大量成纖維細(xì)胞，由于心肌細(xì)胞的貼壁時間為4～24h，因此，我們將第1 次差速貼壁后收集的上清液進行第二次差速貼壁，時間為1h。在培養(yǎng)細(xì)胞接種密度上，細(xì)胞接種密度對細(xì)胞正常生長也同樣重要，細(xì)胞過密導(dǎo)致營養(yǎng)不良，細(xì)胞過疏也將降低細(xì)胞間信號傳遞，由于大多數(shù)實驗室暫無標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞接種密度，我們根據(jù)William 等[9]的研究，推薦使用1.5×105/10cm2的細(xì)胞密度進行接種。我們所分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在搏動節(jié)律上一致，搏動頻率在培養(yǎng)第2～11天無明顯差異。通過以上三點的改進，我們在體外分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞存活率在培養(yǎng)第2 天達(dá)（95.33±2.51）%，在培養(yǎng)第11 天達(dá)（48.67±3.21）%，是前面的研究所沒有觀察到的[8，10]。

綜上所述，我們在短時間內(nèi)體外分離培養(yǎng)獲得純度高、存活率高、生長狀態(tài)良好的成片狀的原代心肌細(xì)胞，有利于今后為心血管疾病的基礎(chǔ)研究提供參考。