黃蘭芳 黃青華 李夢澤 侯長春 閆萍

支氣管哮喘是一種表現(xiàn)為可逆性呼氣困難的氣道慢性炎癥[1]，其后期亦有不可逆呼吸困難出現(xiàn)，氣道重塑是哮喘中出現(xiàn)不可逆呼氣困難的原因之一[2，3]。氣道重塑與氣道平滑肌有關(guān)，氣道平滑肌的增生、肥大以及基膜增厚均使哮喘患者哮喘發(fā)作時出現(xiàn)不可逆呼氣困難，給支氣管哮喘的治療增加難度[4～6]。故氣道平滑肌的培養(yǎng)及研究對探究支氣管哮喘有重要的作用。本研究通過探討兩種不同方法培養(yǎng)氣道平滑肌細(xì)胞，觀察其生長特點并對比兩種方法的利弊，為后續(xù)細(xì)胞實驗做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料新鮮人支氣管組織、滅菌后pH 為7.2～7.4 的PBS（雷根生物）、高糖DMEM（Gibco）、膠原酶I（賽默飛）、胎牛血清（以色列BI）、青霉素-鏈霉素（BI）、含0.25%EDTA 胰蛋白酶（索萊寶），α-actin 抗體（美國CST），F(xiàn)ITC 熒光二抗（索萊寶）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 經(jīng)與患者簽署知情同意書后，取我院胸外科2019年3～10月行肺葉切除術(shù)肺癌患者的正常肺葉、段支氣管標(biāo)本。將正常肺葉、段支氣管切下后立即放入已加雙抗的冰冷PBS 中，用冰盒運送至實驗室。在超凈臺中用已加雙抗的冰冷PBS 反復(fù)清洗支氣管組織3～5 遍，用無菌手術(shù)刀將支氣管表面的結(jié)締組織刮除，眼科剪剪開支氣管，手術(shù)刀輕輕刮除內(nèi)面內(nèi)皮組織，小心剔除軟骨、外膜及內(nèi)皮組織。然后將支氣管轉(zhuǎn)移至干凈滅菌的5ml 離心管，用眼科剪將組織剪碎，剪成1mm3左右大小的組織塊。將每例標(biāo)本剪碎的組織塊平均分成2 份，分別用組織塊貼壁法和酶解離法進行細(xì)胞培養(yǎng)，并計算成功率和污染率。成功率為成功培養(yǎng)出氣道平滑肌細(xì)胞的例數(shù)/總例數(shù)×100%；污染率為污染的例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.2.2 組織塊貼壁法 在剪碎的支氣管平滑肌組織中加入一滴血清，用眼科鑷均勻（每個小塊組織相隔0.5～1cm）平鋪于25ml 滅菌培養(yǎng)瓶底面，放置好組織塊后，輕柔翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶底部朝上，然后置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，組織貼壁5～10h后，在無菌條件下沿著側(cè)壁向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，并翻轉(zhuǎn)瓶底。繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5 天換一次液。每次換液均應(yīng)輕柔操作，切勿使組織塊移動。

1.2.3 酶解離法 在裝有剪碎的支氣管平滑肌組織的離心管中加入2ml 雙抗高糖DMEM，加入膠原酶I，使其最終濃度為0.1%，封口膠封口，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中消化3h，然后加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 2ml 終止消化，1 000r/min 離心5min，去上清，加入新鮮含10%胎牛血清的高糖DMEM 5ml，轉(zhuǎn)移至25ml 滅菌培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 天內(nèi)切勿移動此培養(yǎng)瓶。每3～5 天換一次液。

1.2.4 細(xì)胞傳代純化 倒置相差顯微鏡下觀察，組織周圍融合細(xì)胞達80%時可用胰蛋白酶消化法傳代。用吸管吸出原培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶中細(xì)胞用滅菌雙抗PBS 清洗2 遍，加入含0.25%EDTA 胰蛋白酶1ml，在室溫下消化1～2min，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，邊緣透亮，并從瓶壁上脫離出來，輕晃瓶身，見大部分細(xì)胞從瓶壁上脫落后，加入含1ml 10%胎牛血清的高糖DMEM 終止消化，用吸管輕輕將殘存在瓶壁上的細(xì)胞吹打下來，將混合液轉(zhuǎn)入離心管中，1 000r/min 離心5min，去上清，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM 后分裝至2～3 個新滅菌培養(yǎng)瓶中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞鑒定 形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、生長特點及排列方式。細(xì)胞免疫熒光鑒定細(xì)胞內(nèi)α-actin：取出1 瓶3～4 代細(xì)胞，胰酶消化后分別接種至放置已滅菌蓋玻片的6 孔板中，每孔約105個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，吸掉培養(yǎng)液。用37℃預(yù)熱的PBS 于搖床清洗3 次，每次5min。使用4%多聚甲醛液在室溫下固定細(xì)胞15min。再用37℃的0.1% TritonX-100 溶液透化處理5min 后，用PBS 于搖床清洗細(xì)胞3 次，每次5min。用2%BSA室溫封閉20min 后，用PBS 于搖床清洗細(xì)胞3 次，每次5min。取適量配置好的α-actin 單克隆抗體工作液，以覆蓋住玻片上的細(xì)胞為宜，4℃過夜。第2 天用PBS 于搖床清洗細(xì)胞3 次，每次5min。FITC室溫避光孵育1h 后用PBS 于搖床清洗細(xì)胞3 次，每次5min。使用含DAPI 溶液的抗熒光淬滅劑對細(xì)胞核進行復(fù)染，封片后于熒光顯微鏡下拍照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)組織塊貼壁法5～7 天可見有圓形小細(xì)胞爬出，細(xì)胞貼壁生長，15～20 天生長至融合，約20天鋪滿瓶底80%以上，此時可以首次傳代（見圖1）。酶解離法7～10 天可見細(xì)胞增多融合，用胰蛋白酶消化法重鋪細(xì)胞后3～5 天可傳代（見圖2）。15 例標(biāo)本兩種方法原代培養(yǎng)均成功，成功率100%，污染率為0。組織塊貼壁法培養(yǎng)出的細(xì)胞能穩(wěn)定傳代至8～10 代；而酶解離法細(xì)胞能傳代至第7 代，到第8 代時細(xì)胞形態(tài)學(xué)開始發(fā)生改變。

圖1 組織塊貼壁法（200×）

圖2 酶解離法（200×）

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫熒光染色結(jié)果倒置相差顯微鏡觀察兩種方法培養(yǎng)的原代細(xì)胞，細(xì)胞呈長梭形、紡錘形或者不規(guī)則三角形，有1～2 個細(xì)胞核。細(xì)胞呈“峰-谷”生長（峰：細(xì)胞呈多層細(xì)胞丘；谷：即單層細(xì)胞處，甚至無細(xì)胞處）。見圖3A。α-actin免疫熒光染色顯示，兩種方法培養(yǎng)的原代氣道平滑肌細(xì)胞95%以上呈強陽性染色，胞漿呈綠色，胞核呈藍色。見圖3B。

圖3 細(xì)胞形態(tài)和免疫熒光染色

3 討論

許多慢性氣道炎癥后期會出現(xiàn)氣道重構(gòu)，導(dǎo)致肺功能下降，而氣道平滑肌的改變在呼吸道炎癥及氣道重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。羅雅玲等[7]認(rèn)為氣道平滑肌是慢性呼吸道疾病中研究價值較高的組成部分，為增加實驗研究的實用性，需培養(yǎng)人氣道平滑肌。然而人氣道平滑肌細(xì)胞存在油脂多、貼壁難的特點，且其對無菌環(huán)境、培養(yǎng)條件要求高，故現(xiàn)有研究中多用小鼠、大鼠或豚鼠的氣道平滑肌進行原代培養(yǎng)。本研究提供了人氣道平滑肌原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法及對比，為后續(xù)細(xì)胞實驗提供基礎(chǔ)。α-actin 是一種具有收縮能力的微絲蛋白，廣泛分布于幾乎所有的肌型細(xì)胞中。α-actin蛋白主要用于檢測骨骼肌、平滑肌、血管平滑肌、心肌和肌原性腫瘤。Actin（肌動蛋白）是在所有真核細(xì)胞中都表達的高度保守的蛋白質(zhì)，也是標(biāo)記平滑肌和肌上皮細(xì)胞腫瘤的有效工具。

人氣道平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)技術(shù)主要有組織塊貼壁法和酶解離法[8，9]。本實驗使用兩種方法均能培養(yǎng)出特異性好、污染率低、純度高的人氣道平滑肌細(xì)胞，但培養(yǎng)出細(xì)胞的生長速度有明顯差異。組織塊貼壁法培養(yǎng)周期較長，但是細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，活力比酶解離法好，并且原代培養(yǎng)細(xì)胞的成功率高。酶解離法培養(yǎng)周期短，雖然也能成功提取原代細(xì)胞，但是細(xì)胞形態(tài)學(xué)不穩(wěn)定，對細(xì)胞的活力有一定影響，并且膠原酶價格昂貴。因此我們認(rèn)為組織塊貼壁法值得推廣使用。此外，本實驗有幾個需要注意的細(xì)節(jié)：①在手術(shù)室中取下患者的氣管組織后需立即放入無菌并加了青霉素-鏈霉素的冰凍PBS 中，用冰盒運送至實驗室，最大程度保持氣管組織的活性。②實驗室內(nèi)于超凈臺上完成后續(xù)步驟。全程盡可能保持無菌操作。用手術(shù)刀操作時，動作輕柔但需盡量清除結(jié)締組織和內(nèi)皮細(xì)胞，減少后續(xù)細(xì)胞的純化時間，眼科剪剪碎支氣管組織時可按需求剪至合適大小，一般以1mm3為佳。使用組織塊法進行貼壁時，可向剪碎的支氣管平滑肌組織中加入一滴血清，增加其粘附性；因人氣道平滑肌存在油脂多的特點，較難貼壁，可將貼壁時間適當(dāng)延長（4～10h），其后再加培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。③原代培養(yǎng)時，前3～5 天要求培養(yǎng)瓶絕對靜置，不可移動。④傳代時，細(xì)胞與胰蛋白酶作用的時間一般1～2min即可，時間太長對原代細(xì)胞造成損害，后續(xù)恢復(fù)原狀的時間會延長甚至恢復(fù)不了正常的梭形形態(tài)。離心后去上清時需小心用吸管吸出上清，避免浪費原代細(xì)胞。