鐘宜科，鄒大陽，趙彤，花曉丹，馮洋，劉威，*，王永霞，*

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056000；2.中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京100000）

在過去的30年食源性疾病的發(fā)病率明顯增加，食源性疾病已經(jīng)成為全球主要的公共問題之一[1]。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）[2]統(tǒng)計(jì)顯示由病原微生物引起的食源性疾病比例達(dá)50%以上。食源性疾病是因?yàn)槭秤弥虏【蚱涠舅匚廴镜氖澄锘蛩稹Ｊ吃葱灾虏【?xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲[3]。據(jù)報(bào)道[4]已被確認(rèn)的食源性致病菌多達(dá)31種。引起食源性疾病常見致病菌為大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、腸道沙門氏菌、空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌和產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌等[1，4]。各種街邊食品[5]、水果，蔬菜等即食食品、生的或未煮熟的食物海鮮、肉類[6]，這些都會(huì)引起食源性疾病的發(fā)生。為確保食品供應(yīng)安全，減少食源性疾病的發(fā)生，對(duì)食品中是否存在食源性致病菌進(jìn)行分析至關(guān)重要。

食源性致病菌的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法和免疫學(xué)方法。其中，傳統(tǒng)培養(yǎng)法[7]是金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣，對(duì)操作人員技術(shù)水平要求比較高且檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要2 d～20 d不等，而且屬內(nèi)種間生化差別不明顯；免疫學(xué)[8]方法是基于抗原抗體特異性結(jié)合的反應(yīng)原理，操作簡(jiǎn)單、方便快速是其突出特點(diǎn)，但其最大的缺點(diǎn)是靈敏性不足，經(jīng)常造成假陰性結(jié)果，容易漏篩，不能完全滿足致病菌的檢測(cè)需求。

多年來，為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性，一種簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏的核酸檢測(cè)方法應(yīng)運(yùn)而生，其通過檢測(cè)目標(biāo)病原體的特定DNA或RNA序列，將目標(biāo)核酸序列雜交到與目標(biāo)序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸（探針或引物）來完成病原體的檢測(cè)。另外，一些產(chǎn)毒素的病原體，如霍亂弧菌、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌等也可通過核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到其中的毒力因子[3]。

1 核酸檢測(cè)技術(shù)

1.1 常規(guī)PCR

常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)是食源性致病菌檢測(cè)常用的分子生物學(xué)方法。常規(guī)PCR可以通過檢測(cè)特定目標(biāo)DNA序列來檢測(cè)食品中存在的單一細(xì)菌病原體。其原理為：首先經(jīng)過熱變性雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA；然后退火，引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合；最后經(jīng)過延伸，合成DNA，獲得目的片段。最后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。Chiang等[9]和Zhou等[10]建立了食品中大腸桿菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、沙門氏菌和志賀氏菌常規(guī)PCR檢測(cè)方法。這種檢測(cè)方特異性強(qiáng)、靈敏度高、儀器便宜，但易受到抑制劑的影響；并且要通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果判讀，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求高。

1.2 多重PCR

多重PCR（multiplex-PCR，mPCR）是由常規(guī)PCR衍生出的一種擴(kuò)增技術(shù)。在一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上的引物，可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的片段，較常規(guī)PCR更加快速方便。引物設(shè)計(jì)是多重PCR最關(guān)鍵的步驟，只有反應(yīng)中引物具有相似的退火溫度時(shí)，才能成功的進(jìn)行多重PCR分析[3]。此外，反應(yīng)體系中的引物濃度、緩沖液、mg2＋和dNTP濃度、DNA模板濃度、反應(yīng)溫度和Taq酶都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果[11]。Park等[12]建立了同時(shí)檢測(cè)食品中大腸桿菌O157：H7（Stx2A）、沙門氏菌（Its）、金黃色葡萄球菌（Cap8A-B）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Hly）的多重PCR方法；Ryu等[13]建立了一種同時(shí)檢測(cè)和鑒別6種李斯特菌的多重PCR方法，且具有較高的特異性；Zhou等[14]建立一種新的多重PCR方法，即GeXP-PCR，可檢測(cè)食品中大腸桿菌O157、單核細(xì)胞增生李斯特菌等6種病原菌。其中，GeXP[15]（genome lab gene expression profiler）多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)與毛細(xì)管電泳分析技術(shù)相結(jié)合，利用帶有熒光標(biāo)記的通用引物和特異性嵌合引物的聯(lián)合擴(kuò)增，使目的基因得到高效表達(dá)，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量及檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）與常規(guī)PCR相比，其不需要對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增后處理，而是通過熒光染料或熒光標(biāo)記特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控[16]。由于其快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高等特點(diǎn)，越來越多的應(yīng)用到食源性致病菌的檢測(cè)中。qPCR還可以通過研究合適的靶基因的表達(dá)來量化食物中的一種特定微生物。目前應(yīng)用較多的qPCR方法有染料法（synergy brands green，SYBR Green）、探針（TaqMan probes）和分子信標(biāo)（molecular beacons）。

SYBR Green是一種只與雙鏈DNA結(jié)合的染料，當(dāng)反應(yīng)液鐘只有單鏈DNA時(shí)，其不發(fā)光，只有摻入DNA雙鏈中才可發(fā)光。其工作原理見圖1。

在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增完成后，SYBR Green染料與雙鏈DNA結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光值升高。Tyagi等[18]建立了一種用于檢測(cè)熱帶貝類中致病性tdh陽性副溶血性弧菌的高靈敏性SYBR Green qPCR檢測(cè)方法；Jun Kawase等[19]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)16種食源性致病菌的SYBR Green qPCR方法。TaqMan探針法的工作原理見圖2。

圖1 SYBR Green熒光定量PCR原理[17]Fig.1 Principle of SYBR green quantitative PCR

圖2 TaqMan探針熒光定量PCR原理[17]Fig.2 Principle of TaqMan probe fluorescence quantitative PCR

探針 3′端淬滅基（quencher，Q）能夠吸收 5′端報(bào)告基團(tuán)（reporter，R）發(fā)出的熒光，因此，沒有擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，無法檢測(cè)到熒光信號(hào)，當(dāng)溶液中有PCR產(chǎn)物（模板）時(shí)，探針與模板退火，即產(chǎn)生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Taq酶的5′外切酶活性，將探針5′端連接的報(bào)告基團(tuán)切割下來，破壞了兩個(gè)熒光分子間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)出熒光，檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)。Fusco等[20]通過TaqMan qPCR定性、定量分析了牛奶中的產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌。

分子信標(biāo)（molecular beacon）[21]是一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸鏈。由3部分組成：（1）環(huán)狀區(qū)：由15～30個(gè)可與靶分子特異性結(jié)合的核苷酸組成；（2）莖干區(qū)：由5個(gè)～8個(gè)可發(fā)生可逆性解離的堿基對(duì)組成；（3）熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)：分子信標(biāo)的兩個(gè)末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。其工作原理見圖3。

沒有靶分子存在的時(shí)候，分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠得很近，熒光被淬滅，但與靶分子結(jié)合后，分子信標(biāo)的空間構(gòu)型發(fā)生了改變，使熒光恢復(fù)。Liming等[22]首次通過分子信標(biāo)qPCR技術(shù)檢測(cè)了水果和蔬菜中的沙門氏菌。

圖3 分子信標(biāo)熒光定量PCR原理[17]Fig.3 Principle of molecular beacon fluorescence quantitative PCR

上述3種方法中，SYBR Green法較TaqMan探針法和分子信標(biāo)法更加便宜和簡(jiǎn)單，并且其擴(kuò)增結(jié)果可通過溶解曲線的Tm值進(jìn)行直觀的判斷。但SYBR Green法檢測(cè)的是體系中的所有雙鏈DNA，因此，反應(yīng)中產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增或引物二聚體，容易造成假陽性，而TaqMan探針法和分子信標(biāo)法是序列特異性探針，只能與靶序列結(jié)合，不會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，較SYBR Green法更加的靈敏，但Klerks等[23]研究表明基于PCR的檢測(cè)方法的靈敏性主要受引物特異性，引物序列和退火溫度的影響。

1.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等[24]在 2000 年建立的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)。該方法需要4條～6條引物特異性的識(shí)別目標(biāo)片段的6個(gè)～8個(gè)區(qū)域，具有簡(jiǎn)單、特異、高效、迅速的優(yōu)點(diǎn)。在DNA聚合酶的鏈置換作用下，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增靶序列，同時(shí)產(chǎn)生白色的焦磷酸鎂，這一特性可通過濁度來判斷。Maruyama等[25]首次通過這種方法進(jìn)行了食源性致病菌大腸桿菌O157：H7（stxa2）的檢測(cè)；Wang等[26]研究表明，由于LAMP引物需特異性的結(jié)合目標(biāo)片段的6～8個(gè)區(qū)域，使得LAMP比PCR具有更高的靈敏性和特異性。目前，由LAMP衍生的檢測(cè)方法有反轉(zhuǎn)錄LAMP[27]、多重LAMP[28]、實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄LAMP[29]等。

1.5 聚合酶螺旋反應(yīng)

聚合酶螺旋反應(yīng)（polymerase spiral reaction，PSR）是由Liuwei等[30]建立的一種新型的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該方法是利用具有熱穩(wěn)定性、鏈置換功能和DNA聚合酶活性的酶（Bst DNA聚合酶）在等溫條下進(jìn)行擴(kuò)增的方法。該法從LAMP引物設(shè)計(jì)中得到啟示，并融合PCR法引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，僅在PCR引物的基礎(chǔ)上從目標(biāo)序列上再取一段序列加到PCR引物的5′端，構(gòu)成正反向復(fù)合引物，滿足了簡(jiǎn)便快速、高靈敏度和特異性的要求。朱淵等[31]建立了銅綠假單胞菌PSR檢測(cè)方法；董德榮[32]通過PSR建立了一種具有高特異、高靈敏性，用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)食品中霍亂弧菌的方法。

1.6 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA），是由Olaf Piepenburg等研發(fā)的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。它依賴于特定的酶和蛋白組合（重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶），在常溫條件下反應(yīng)5 min～20 min即可獲得結(jié)果。目前，由RPA衍生出的檢測(cè)方法有直接重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Direct-RPA）[33]、重組酶聚合酶擴(kuò)增側(cè)流層析技術(shù)（RPALFD）[34]、實(shí)時(shí)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Rea-ime RPA）[35]等。Ji等[36]建立了腸炎沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光RPA快速檢測(cè)方法，用于檢測(cè)雞蛋和雞肉中的腸炎沙門氏菌。研究發(fā)現(xiàn)，該方法和實(shí)時(shí)熒光PCR相比，具有檢測(cè)時(shí)間更短，靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)。郭燕華等[37]以Cytb基因?yàn)榘行蛄校⒘艘环N用于檢測(cè)生鮮肉中豬源成分的RPA技術(shù)，該方法能快速鑒別豬肉中的豬源成分，特異性好，靈敏度高。Heeseop等[38]建立了一種基于紙芯片的一步法RPA，于37℃反應(yīng)20 min即可獲得結(jié)果。

快速檢測(cè)食品中的食源性致病菌，防止食源性疾病的爆發(fā)和食源性致病菌的傳播具有重要意義。目前，已經(jīng)建立許多食源性致病菌快速檢測(cè)方法，見表1。

表1 核酸檢測(cè)技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用Table 1 Examples of the application of nucleic acid-based methods for the detection of various foodborne pathogens present in food samples

但是大多數(shù)的方法需要一些技術(shù)人員、昂貴的儀器，只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，限制了其使用范圍?；诤怂釞z測(cè)的方法都有其各自優(yōu)點(diǎn)和局限性見表2。

但是怎么將這些優(yōu)點(diǎn)集于一體，是我們未來研究的重點(diǎn)。本文綜述了10年來基于部分核酸快速檢測(cè)方法及其在食源性細(xì)菌性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用及其優(yōu)點(diǎn)和局限性。

表2 快速檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和局限性Table 2 The summary of advantages and limitations of each rapid detection methods

2 結(jié)論

以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的食源性致病菌檢測(cè)方法具有選擇性，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在實(shí)際使用中，需要數(shù)天到一周的時(shí)間，因此急需建立快速的檢測(cè)方法，以此來克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性?？焖贆z測(cè)食品中的食源性致病菌，防止食源性疾病的爆發(fā)和食源性致病菌的傳播具有重要意義。新興的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如LAMP、RPA和PSR因其操作簡(jiǎn)單、不需要熱循環(huán)以及不需要大型儀器等，未來其在食源性致病菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)具有廣泛的前景。

幾十年來，研究人員在食源性致病菌檢測(cè)方面進(jìn)行了大量研究，但目前的技術(shù)仍需要改進(jìn)。所有的快速檢測(cè)方法都需要一定的前處理，這是快速檢測(cè)中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，也是快速檢測(cè)發(fā)展中的一個(gè)瓶頸。食品基質(zhì)、致病菌的數(shù)量（＜100 CFU/g）都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的正確性。綜合各種方法的優(yōu)點(diǎn)，創(chuàng)造新的檢測(cè)方法，以此加快食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)進(jìn)程。