（漯河食品職業(yè)學(xué)院食品工程系，河南漯河462000）

洋蔥，人們常稱為球蔥、蔥頭、玉蔥或者皮牙子，是生長(zhǎng)周期兩年的草本科植物，是一種性價(jià)比非常高的蔬菜，也是調(diào)味料的主要成分[1]。洋蔥中的營(yíng)養(yǎng)成分含量非常可觀，鉀、維生素C、葉酸、鋅、硒、植物多酚及纖維質(zhì)等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與他蔬菜相比含量較高，更令科學(xué)家驚喜的是槲皮素和前列腺素A這兩種生理活性物質(zhì)在洋蔥中的含量也比較高，這兩種物質(zhì)使洋蔥具有了許多獨(dú)特的保健功能[2]。

洋蔥含有大量的多酚類化合物，對(duì)其的提取研究目前已經(jīng)出現(xiàn)的有超高壓提取法、乙醇浸提法、微波輔助提取法等，但用超聲波輔助提取洋蔥多酚的方法還少有報(bào)道。本研究擬考察通過(guò)單因素試驗(yàn)分別探討超聲功率、超聲處理時(shí)間、乙醇濃度、固液比4個(gè)單因素對(duì)洋蔥多酚得率的影響；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[3]，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面法分析試驗(yàn)，確定超聲輔助提取洋蔥多酚的最佳提取條件。并對(duì)得到的多酚物質(zhì)進(jìn)行體外抗氧化活性分析，對(duì)洋蔥的綜合利用和開發(fā)提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮紫皮洋蔥：漯河千盛購(gòu)物廣場(chǎng)；

福林酚試劑：天津華特化科技有限責(zé)任公司；沒(méi)食子酸、三羥基氨基甲烷（Tris）：美國(guó)Sigma公司；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、鄰苯三酚以上試劑均為分析純。

NCGF無(wú)水碳恒溫干燥箱：南京鑫長(zhǎng)江制藥設(shè)備有限公司；WN500萬(wàn)用粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；FA1004電子分析天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：上海天實(shí)機(jī)電設(shè)備有限公司；TG16-W微量高速臺(tái)式離心機(jī)：張家港新華化工機(jī)械有限公司；WFZUV-2800AH紫外可見分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，得到濃度為1 mg/mL的沒(méi)食子酸母液。準(zhǔn)確吸取 0、1、2、3、4、5 mL 標(biāo)準(zhǔn)液于 100 mL 容量瓶中，加入蒸餾水定容，得到 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL于4 mL的離心管中，加入1 mL 0.25 mol/L的福林酚試劑，混合均勻靜置3 min，加入2 mL15%Na2CO3混合，靜置30 min，3 500 r/min離心3 min，760 nm處測(cè)吸光值。每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值。根據(jù)沒(méi)食子酸含量及對(duì)應(yīng)的吸光度繪制出沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為：y=28.443x+0.0677 9，r2=0.999 6。

1.2.2 洋蔥多酚的提取

把6 kg紫皮洋蔥用自來(lái)水沖洗干凈，去皮，切塊，裝盤后放入電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱50℃恒溫干燥60 h。使用WN500型萬(wàn)用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩備用。

洋蔥中多酚含量的提取方法采用Folin-Ciocalteu試劑法[4]。1mL經(jīng)超聲處理后的樣品液與1mL0.25 mol/L Folin試劑混合均勻，放置3 min，加入15%的Na2CO3溶液2 mL，再次混合、放置30 min，試樣經(jīng)3500 r/min的高速離心機(jī)離心3 min，在760 nm處測(cè)吸光度。洋蔥多酚得率照下式計(jì)算：

式中：W為多酚得率，mg/g；C為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為洋蔥粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 多酚提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)地考察超聲處理對(duì)洋蔥多酚得率的水平高低，分別選擇超聲功率（200、250、300、350、400 W）、超聲處理時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%）和固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面分析，選取超聲功率、超聲處理時(shí)間、乙醇濃度和固液比為4因子，每個(gè)因素選擇包括最佳水平在內(nèi)的3水平，進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)。通過(guò)響應(yīng)面分析結(jié)果找到最優(yōu)的超聲處理參數(shù)。因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4 體外抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.4.1 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

取2 mL的樣品溶液和2 mL DPPH溶液（0.2 mmol/L）放入試管中，充分?jǐn)嚢韬笤陉帥霰芄馓幏胖?0 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度A1。同樣方法測(cè)定2 mL無(wú)水乙醇和2 mL樣品溶液充分混勻后的吸光度A2和2 mL DPPH溶液加入2 mL蒸餾水的吸光度A0，同時(shí)用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照[5]。

DPPH 自由基清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]×100

1.2.4.2 羥自由基清除活性測(cè)定

取不同濃度的粗多酚樣品溶液1 mL分別加入到試管中，分別依次加入1 mL 8 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，1 mL 8 mmol/L H2O2[6]。充分混勻后靜置1 h，在510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)2。同樣方法，用蒸餾水替代樣品測(cè)得吸光度A0；用蒸餾水替代H2O2測(cè)得吸光度A1。同時(shí)用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。

羥自由基清除率/%=[1－（A2－A1）/A0]×100

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定

取pH值為8.2質(zhì)量濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，放入25℃恒溫水浴中保持30 min，分別加入0.4 mL質(zhì)量濃度為25 mmol/L的鄰苯三酚溶液和1 mL樣品溶液，攪拌均勻后在25℃恒溫水浴中放置4 min，加入1 mL質(zhì)量濃度為8 mmol/L的鹽酸溶液搖勻。在波長(zhǎng)320 nm處測(cè)定吸光度記為A1，同法以1 mL蒸餾水代替樣品測(cè)得吸光度記為A0[7]。同時(shí)用VC標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照。

超氧陰離子自由基清除率/%=（1－A1/A0）×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析，其余運(yùn)用Microsoft excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)洋蔥多酚得率的影響

超聲功率對(duì)洋蔥多酚得率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對(duì)洋蔥多酚得率的影響Fig.1 The impact of ultrasonic power on onion polyphenols extract single factor test results

從圖1中可以發(fā)現(xiàn)超聲處理對(duì)洋蔥多酚得率影響比較顯著，在超聲功率為350 W處，洋蔥多酚物質(zhì)提取率最大，為10.33 mg/g。當(dāng)超聲功率大于350 W后，多酚得率開始下降。研究表明，超聲波的空化作用和機(jī)械作用[9]可以起到破壞植物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、加快分子的運(yùn)動(dòng)速率的作用，并且超聲功率越增強(qiáng)，植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞得越嚴(yán)重，可以促使細(xì)胞內(nèi)多酚物質(zhì)的析出，最終導(dǎo)致多酚得率的降低。因此根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果，超聲功率以350 W最為合適。

2.1.2 超聲處理時(shí)間對(duì)洋蔥多酚得率的影響

超聲處理時(shí)間對(duì)洋蔥多酚得率的影響見圖2。

圖2 超聲處理時(shí)間對(duì)洋蔥多酚得率的影響Fig.2 The impact of ultrasonic processing time on onion polyphenols extract single factor test results

從圖2中可以看出，在超聲處理時(shí)間為0.5 h～1 h內(nèi)，洋蔥多酚提取率增幅很大，并且在處理時(shí)間為1 h處，洋蔥多酚得率最大，為10.154 mg/g。但是隨著提取時(shí)間的增加，洋蔥多酚得率卻逐漸減小，差異顯著。這一現(xiàn)象表明在一定的超聲處理時(shí)間段內(nèi)，時(shí)間越長(zhǎng)越有利于多酚物質(zhì)的溶出；但是這個(gè)時(shí)間段之后，洋蔥多酚得率開始減小。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)超聲波熱效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致洋蔥中部分不太穩(wěn)定的多酚分解轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，故在測(cè)量時(shí)會(huì)使得吸光度減小，最終導(dǎo)致計(jì)算得到的洋蔥多酚得率數(shù)值變小。不過(guò)也可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的超聲處理導(dǎo)致某些親醇類的物質(zhì)溶出，這也會(huì)降低洋蔥多酚的提取率。同時(shí)超聲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，浸出的洋蔥多酚物質(zhì)可能在溶液內(nèi)被氧化[10]，這也會(huì)對(duì)提取率造成一定的影響。最后，在實(shí)際操作中考慮到超聲處理時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致能耗和成本的增加，因此選擇超聲處理時(shí)間為1 h較為合適。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)洋蔥中多酚得率的影響

乙醇濃度對(duì)洋蔥中多酚得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)洋蔥多酚得率的影響Fig.3 Ethanol volume fraction of onion polyphenols extraction effect of singe factor test results

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度在20%～80%范圍內(nèi)，洋蔥中的多酚得率隨著乙醇濃度的變大而增加，差異顯著，在乙醇濃度為80%時(shí)，洋蔥中的多酚得率達(dá)到最大值為10.178 mg/g。但是將乙醇濃度擴(kuò)大至100%時(shí)，洋蔥多酚得率卻反而下降至7.76 mg/g。眾所周知，多酚類物質(zhì)經(jīng)常與一些大分子物質(zhì)通過(guò)化學(xué)鍵例如氫鍵形成復(fù)合物，當(dāng)乙醇濃度較低、水分含量較高時(shí)，對(duì)氫鍵的破壞作用較小，這會(huì)造成多酚類物質(zhì)不易溶出，最終使得通過(guò)超聲波輔助提取得到洋蔥中的多酚提取率不太樂(lè)觀。但是當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加，一些脂類、色素等雜質(zhì)就會(huì)溶解[11]，這些成分會(huì)與多酚物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，同乙醇水分子結(jié)合，最終導(dǎo)致多酚活性物質(zhì)的溶解度降低，對(duì)多酚的提取率會(huì)造成一定的影響。因此選擇乙醇濃度為80%較為合適。

2.1.4 固液比對(duì)洋蔥多酚得率的影響

固液比對(duì)洋蔥多酚得率的影響見圖4。

圖4 固液比對(duì)洋蔥多酚得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of onion polyphenol

從圖 4中可以發(fā)現(xiàn)，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）范圍內(nèi)，洋蔥多酚得率隨著液體體積的變大而減小，差異明顯。當(dāng)固液比大于1∶20（g/mL），洋蔥多酚的得率隨著液體體積的增大而增大，并且當(dāng)固液比為1 ∶40（g/mL）時(shí)，洋蔥多酚得率最大為11.737 mg/g。之后繼續(xù)增大到固液比1∶50（g/mL），洋蔥的多酚得率不升反降。因而選擇固液比為1∶40（g/mL）較為合適。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以超聲功率、超聲時(shí)間、乙醇濃度和固液比為自變量，以洋蔥多酚物質(zhì)的得率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析。試驗(yàn)多次，使用Design Expert8.0.6將數(shù)據(jù)分析，其響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design and response results values

續(xù)表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)結(jié)果Continue table 2 Box-Benhnken design and response results values

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表3可以看出，該回歸模型P＜0.000 1，方程模型極顯著。失擬項(xiàng)P=0.516 9＞0.05不顯著；該模型的確定系數(shù)R2=0.946 5，校正確定系數(shù)R2Adj=0.892 9，變異系數(shù)CV=5.14%，以上參數(shù)說(shuō)明該模型擬合性好，試驗(yàn)誤差小。根據(jù)回歸系數(shù)，得到洋蔥多酚得率的二次多元回歸方程為：

Y=12.26-0.52A-0.69B＋0.94C-0.36D＋1.71AB-0.15AC-0.05AD＋0.85BC＋0.63BD-0.92CD-1.21A2-1.63B2-0.98C2-1.14D2

由表3中方差結(jié)果可知，超聲提取洋蔥多酚的工藝參數(shù)中，對(duì)多酚得率影響的大小順序?yàn)椋篊固液比＞B超聲時(shí)間＞A超聲功率＞D乙醇濃度。其中C固液比、B超聲時(shí)間和A超聲功率達(dá)到極顯著水平，D乙醇濃度達(dá)到顯著水平?？疾旄饕蛩亻g交互作用，AB、BC、BD、CD存在交互作用，其中AB、BC和CD達(dá)到極顯著水平，BD乙醇濃度達(dá)到顯著水平。

2.2.2 兩因素交互作用響應(yīng)面分析

根根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖，通過(guò)觀察響應(yīng)面的變化情況和稀疏程度可直觀地反映各因素相互作用對(duì)多洋蔥多酚得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 兩因素交互作用對(duì)多酚得率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of interaction of two factors on polyphenol yield

當(dāng)響應(yīng)面的坡度越陡峭、等高線越密集而呈現(xiàn)扁圓形或馬鞍形時(shí)，則表示兩因子交互作用越顯著。通過(guò)對(duì)比，圖 5（a）、（d）、（e）、（f）這 3 個(gè)圖的曲面較陡峭、等高線較密集，圖 5（b）和（c）次之。表明超聲功率（A）和超聲時(shí)間（B）、超聲時(shí)間（B）和固液比（C）、超聲時(shí)間（B）和乙醇濃度（D）、固液比（C）和乙醇濃度（D）的交互作用顯著，與表3分析結(jié)果一致。

2.2.3 最佳條件的確定和模型的驗(yàn)證

運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)洋蔥多酚提取率的二次多項(xiàng)模型實(shí)行了優(yōu)化，選出超聲提取洋蔥多酚的最佳工藝參數(shù)：超聲功率321.48 W、超聲時(shí)間0.77 h、固液比1∶45.57（g/mL）、乙醇濃度75%，預(yù)測(cè)洋蔥多酚得率為12.9161 mg/g?？紤]實(shí)際情況和可操作性，將洋蔥多酚的最優(yōu)的工藝參數(shù)設(shè)定為：超聲功率320 W、超聲時(shí)間0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度75%，在此條件下得到的得率為12.77 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明了該模型可靠。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 DPPH自由基清除作用

洋蔥多酚和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖6。

圖6 洋蔥多酚和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of onion polyphenol and VCon DPPH radical scavenging rate

當(dāng)洋蔥多酚的濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時(shí)，隨著洋蔥中多酚濃度的不斷增加，其對(duì)DPPH自由基的清除率呈上升趨勢(shì)。繼續(xù)提高多酚濃度時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率不升反降。當(dāng)洋蔥多酚的濃度為0.3 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到86.2%。

2.3.2 洋蔥多酚對(duì)羥自由基清除活性分析

洋蔥多酚和VC對(duì)對(duì)羥自由基清除率的影響見圖7。

從圖7中可以看出，當(dāng)洋蔥中多酚的濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時(shí)，隨著洋蔥中多酚濃度的增加，對(duì)羥自由基的清除率也不斷提高，當(dāng)洋蔥多酚的濃度為0.3 mg/mL時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到86.4%。

圖7 洋蔥多酚和VC對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.7 Effect of onion polyphenol and VCon hydroxyl radical scavenging rate

2.3.3 洋蔥多酚對(duì)超氧陰離子清除活性分析

洋蔥多酚和VC對(duì)超氧陰離子清除率的影響見圖8。

圖8 洋蔥多酚和VC對(duì)超氧陰離子清除率的影響Fig.8 Effect of onion polyphenol and VCon superoxide anion scavenging rate

從圖8中可以看出，當(dāng)洋蔥中多酚濃度在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL之間時(shí)，隨著多酚濃度的增加，對(duì)超氧陰因子的清除能力也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)洋蔥中多酚濃度為0.3 mg/mL時(shí)，清除率最高，達(dá)到80.6%。

3 結(jié)論

本文以紫皮洋蔥為原料，對(duì)超聲輔助提取洋蔥多酚的工藝進(jìn)行了研究。采用響應(yīng)面分析法，優(yōu)化了超聲提取洋蔥多酚的工藝參數(shù)。優(yōu)化得到的洋蔥多酚提取工藝參數(shù)為：超聲功率320 W、超聲時(shí)間0.8 h、固液比1∶45（g/mL）、乙醇濃度75%。此條件下，洋蔥多酚的得率為12.77 mg/g。體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，在0.05 mg/mL～0.3 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，洋蔥多酚對(duì)DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子自由基具有較強(qiáng)的清除性，表明洋蔥多酚具有良好的體外抗氧化活性，但洋蔥多酚的抗氧化能力比VC弱。