蔡毅，孫振華，馬雯芳，吳劍麗，鐘珍林

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200）

桑椹是?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥果穗[1]。早在《爾雅》，《本草綱目》上便有記載，其鮮果可直接食用，晾曬干燥可做藥用，是歷史悠久的藥食兩用品，其性寒，有滋陰養(yǎng)血、生津、潤(rùn)腸之功，治療血虛精虧，須發(fā)早白，傷津口渴之效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗氧化、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等藥理作用[3-4]。近年對(duì)桑椹抗氧化作用的研究主要集中在其酚類成分的抗氧化活性評(píng)價(jià)[5-6]，未見有以抗氧化作用為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)桑椹抗氧化活性成分群提取工藝優(yōu)化相關(guān)研究的報(bào)道。本文充分考慮多種成分的提取效率，以藥效為考察指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化活性成分群的提取工藝，并對(duì)不同產(chǎn)地、不同流通地、采摘與市售桑椹的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為相關(guān)產(chǎn)品的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5810R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；DP5系列超純水儀：法國(guó)密里博公司；UV 2600紫外可見光分光光度計(jì)：日本島津公司。

DPPH試劑（批號(hào)：6 KCYN-LT）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；甲醇、乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

從全國(guó)各地采集桑椹藥材30批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為?？浦参锷５母稍锍墒旃?。從廣西、四川等桑椹主產(chǎn)區(qū)采摘藥材15批，從四川、江蘇等省區(qū)購(gòu)買市售桑椹藥材15批。藥材信息表見表1，全部批次樣品經(jīng)干燥處理后粉碎，過24目篩，備用。

表1 桑椹藥材信息表Table 1 Information of Mori Fructus

續(xù)表1 桑椹藥材信息表Continue table 1 Information of Mori Fructus

1.2 方法

1.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取DPPH試劑19.76 mg，置于100 mL容量瓶中，加90%甲醇至刻度，配置成0.5 mmol/L的DPPH溶液，再依次稀釋成0.4、0.3、0.2、0.1 mmol/L的溶液，以90%甲醇為空白對(duì)照，在517 nm處測(cè)定，得到以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)的回歸方程。

1.2.2 DPPH溶液的制備

精密稱取DPPH試劑39.45 mg，配置成0.4 mmol/L的DPPH溶液，備用。

1.2.3 單因素考察

1.2.3.1 提取溶劑考察

精密稱取桑椹藥材（S10）9份，各0.3 g，分別精密加入50%甲醇、50%乙醇、純水各20 mL，超聲提取（400 W，40 kHz）30 min，濾過，得到提取原液。取過濾原液逐步稀釋，得到原液，以及 1/2、1/4、1/6、1/8、1/16、1/32、1/64倍原液濃度，8組不同濃度的供試品溶液。

分別精密移取1 mL提取溶劑，加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液中，混勻，以90%甲醇為空白參比，測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。

分別精密移取1 mL供試品溶液加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，以90%甲醇為空白參比，測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。

分別取1 mL供試品溶液加入到3 mL 90%甲醇中，混勻，以90%甲醇為空白參比，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。

1.2.3.2 乙醇濃度考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，加入30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇各20 mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，濾過，分別測(cè)定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。

1.2.3.3 提取時(shí)間考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，分別以超聲提取處理 20、30、40 min，分別測(cè)定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。

1.2.3.4 溶劑用量考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，分別精密加入50%乙醇 20、25、30 mL，分別測(cè)定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇優(yōu)化后的試驗(yàn)因素，以IC50值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化各因素水平，考察乙醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間對(duì)半數(shù)清除率的影響，以抗氧化效應(yīng)為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件，因素-水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素-水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，得到回歸方程，Y=9.441 57X+0.113 283，r2=0.999 16，表明在0.1 mmol/L～0.5 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系，線性關(guān)系圖見圖1。

圖1 線性關(guān)系圖Fig.1 Linear diagram

2.1.2 提取溶劑考察

提取溶劑考察表結(jié)果見表3。

由表3可知，乙醇相較于甲醇和水提取液IC50值更小，抗氧化能力更優(yōu)，且考慮乙醇無(wú)毒性，用乙醇提取更為安全，因此，采用乙醇作為提取溶劑。

表3 提取溶劑考察表Table 3 Solvent extraction research

2.1.3 乙醇濃度考察

乙醇濃度考察表見表4。

表4 乙醇濃度考察表Table 4 Ethanol concentration research

由表4可知，50%乙醇提取液IC50值最小，為0.078，因此采用50%乙醇作為提取溶劑。

2.1.4 提取時(shí)間考察

提取時(shí)間考察結(jié)果見表5。

表5 提取時(shí)間考察表Table 5 Extracting time research

由表5可知超聲提取30 min的IC50較小，抗氧化能力較強(qiáng)，因此提取時(shí)間選定為30 min。

2.1.5 溶劑用量考察

溶劑用量考察結(jié)果見表6。

表6 溶劑用量考察表Table 6 Solvent dosage research

由表6可知，當(dāng)溶劑用量為20 mL時(shí)IC50值較小，抗氧化能力較優(yōu)，因此溶劑用量為20 mL。

2.2 正交優(yōu)化結(jié)果與分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照1.2.4項(xiàng)下正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表7，方差分析結(jié)果見表8。

表8 方差分析結(jié)果Table 8 Variance analysis

由表7、表8可知，試驗(yàn)最佳工藝組合為A2B1C2，K值最優(yōu)為A2B1C1；正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明，A（乙醇濃度）、B（溶劑用量）兩個(gè)因素對(duì)桑椹羥基自由基半數(shù)清除率IC50有顯著影響，且各因素影響的程度依次為：B（溶劑用量）＞A（乙醇濃度）＞C（提取時(shí)間）。

為進(jìn)一步確定最佳提取工藝，比較直觀分析所得提取工藝與正交試驗(yàn)分析得到的桑椹抗氧化活性成分群最佳提取工藝，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果見表9。

表9 最佳工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3）Table 9 Optimum process validation research

驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明，工藝組合A2B1C2的羥基自由基半數(shù)清除率IC50值更低，即抗氧化能力更強(qiáng)，確定最佳提取工藝為50%乙醇20 mL超聲提取30 min。

2.3 不同批次桑椹抗氧化活性測(cè)定

分別稱取各批次桑椹藥材（50目）各0.3 g，精密稱定，精密加入50%乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液1 mL與3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，以90%甲醇為空白參比，在517 nm處分別測(cè)定 A0、A1、A2，并計(jì)算 IC50，30 批次不同產(chǎn)地、不同流通地、采摘與市售不同藥材羥基自由基半數(shù)清除率IC50在0.041～0.456之間，抗氧化作用良好，測(cè)定結(jié)果見表10。

表10 不同批次桑椹藥材抗氧化作用測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 10 Antioxidant activity determination results of all batches of Mori Fructus

3 結(jié)論

人體的自由基是不斷地產(chǎn)生和消除的過程，衰老自由基理論認(rèn)為自由基攻擊細(xì)胞成分，引發(fā)衰老的一系列損傷，自由基與生物體的壽命存在強(qiáng)相關(guān)關(guān)系[8]。DPPH是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，在溶液中顯深紫色，其可以捕獲氧化劑的自由基，與自身孤電子配對(duì)，使顏色變黃、變淺，且變化程度與自由基清除率呈線性關(guān)系，是評(píng)價(jià)天然抗氧化劑的一種常用方法[9-10]。

本文以桑椹抗氧化作用為考察指標(biāo)，采用DPPH法，以羥基自由基半數(shù)清除率IC50測(cè)定指標(biāo)，在單因素考察的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)法，以乙醇濃度、溶劑用量、提取時(shí)間為考察因素，優(yōu)化建立桑椹活性成分群提取工藝，確定桑椹自由基清除能力最佳的活性成分群提取工藝為50%乙醇20 mL超聲提取30 min，經(jīng)驗(yàn)證該工藝穩(wěn)定可行，試驗(yàn)結(jié)果明確了50%乙醇提取物是桑椹發(fā)揮抗氧化作用的最佳活性部位。對(duì)不同產(chǎn)地、不同流通地、采摘與市售桑椹的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，各批次桑椹羥基自由基半數(shù)清除率IC50在0.041～0.456，抗氧化作用良好。廣西來(lái)賓市采摘味甜的桑椹抗氧化性最強(qiáng)，但綜合全部采摘與購(gòu)買的桑椹樣品抗氧化作用無(wú)明顯差異，酸、甜不同的口感與抗氧化作用間沒有直接的相關(guān)性。

本文采用DPPH法基于自由基清除能力考察建立了桑椹活性成分群提取的最佳工藝，并對(duì)不同批次桑椹樣品抗氧化效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，為后期相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。