龔乃超，鎖進猛，李夢婷，張浩，樂薇

（武漢工商學院環(huán)境與生物工程學院，湖北武漢430065）

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth、石虎 Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa（Juss.）的干燥近成熟果實。常用于治療厥陰頭痛、寒病腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、院腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等，外治口瘡，高血壓癥[1]。藥理研究表明，生物堿類和苦味素類是吳茱萸的主要活性成分[2-4]，目前吳茱萸堿與次堿提取的方法有炮制法[5]、回流法、索氏提取法、超聲波提取法[6-9]、微波提取技術(shù)[10-12]、超臨界流體萃取[13]等方法。傳統(tǒng)的溶劑提取法存在能耗高、周期長、工序多、收率低、勞動強度大，高溫破壞熱敏性成分等不足。隨著工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的擴大，傳統(tǒng)提取技術(shù)的種種缺陷，越來越制約了人們對中藥資源的開發(fā)利用。內(nèi)部沸騰法是韋藤幼等[14]提出的一種強化提取過程的新方法，具有提取溫度低、速度快、操作簡單的特點，對提取熱敏性物質(zhì)更具有優(yōu)勢，在中藥提取和天然化學成分研究等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[15]，將為中藥研究開辟一個新的途徑以及中藥復方的提取工藝研究帶來極大的便利，但將其應(yīng)用于中藥方劑的提取僅剛剛開始，創(chuàng)新研究的空間和前景很大。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吳茱萸：江西省宜春市國苑中藥材有限公司；吳茱萸堿、吳茱萸次堿（標準品/100801001）：天津一方科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-50E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SP752型紫外分光光度器：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；5810R型高速冷凍離心機：德國艾本德儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；AUY120電子天平：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙波長分光光度法測定吳茱萸堿與次堿的含量

基于文獻[16-19]報道的雙波長分光光度法的測定原理，提出了利用雙波長法同時測定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法，該法首先測定提取液溶液在224、344 nm處的吸光度值，利用聯(lián)合方程同時求解出吳茱萸堿與次堿濃度。

聯(lián)合方程如下：

按照上式計算得出吳茱萸堿與次堿濃度，代入下式計算得率：

式中：c為吳茱萸堿或次堿濃度的濃度，（μg/mL）；m為吳茱萸粉末的質(zhì)量，g；V為定容的體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；δ 為質(zhì)量轉(zhuǎn)換單位，（δ=1.0×106）。

1.3.2 超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法

1）采取少量乙醇溶液潤濕吳茱萸粉末于30℃下超聲波一段時間，以使吳茱萸堿與次堿與能被充分解吸。

2）解吸后再取一定量30℃的水，將其置于精密恒溫水浴槽中，并迅速減壓到某一壓力下，使物料內(nèi)部有少量氣泡連續(xù)冒出，提取一段時間。

1.3.3 正交試驗設(shè)計

選取解吸劑用量（A）、解吸時間（B）、操作壓力（C）與減壓時間（D）進行L9（34）正交試驗設(shè)計，因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素表Table 1 Factors orthogonal test table

1.3.4 其他方法提取吳茱萸堿與次堿

采用其他提取方法分別對吳茱萸堿與次堿進行提取，并利用雙波長分光光度法測定提取液中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量。以吳茱萸堿與次堿得率為考察指標，將本法與傳統(tǒng)熱炮制提取法、超聲提取法、微波提取法相比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

吳茱萸堿和吳茱萸次堿標準品的紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 吳茱萸堿與吳茱萸次堿標準品的UV光譜圖Fig.1 Evodiamine and rutecarpine standard ultraviolet-visible spectra

由圖1可知，吳茱萸堿在224 nm處有最強吸收峰，吳茱萸次堿標準品在215 nm和344 nm有最強吸收峰，215 nm處為二氫吲哚堿類的紫外吸收帶[19]，因此，在進行雙波長分光光度法測定吳茱萸堿與次堿含量時，選擇224 nm與344 nm。

2.2 吳茱萸堿與次堿標準曲線的制作

精密稱取吳茱萸堿和次堿對照品2.5 mg，用無水乙醇配成50 μg/mL的吳茱萸堿母液。分別準確量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 吳茱萸堿母液，用無水乙醇定容于50 mL容量瓶。分別在吳茱萸堿和次堿最大吸收波長下測吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制吳茱萸堿和次堿的標準曲線，見圖2。

圖2 吳茱萸堿、次堿含量測定標準曲線Fig.2 Evodiamine and rutecarpine content determination of standard curve

2.3 超聲解吸過程對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.3.1 解吸劑濃度對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

準確稱取吳茱萸1.00g，按照1.3.2方法提取吳茱萸堿與次堿，并測其得率（下同），解吸劑濃度對吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖3所示。

由圖3可知，隨著乙醇濃度的增加，吳茱萸堿與次堿的得率也隨之增加，80%的乙醇對植物細胞具有最大的滲透和解吸能力，所以本試驗選擇80%的乙醇作為最佳解吸劑濃度。

圖3 解吸劑濃度對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.3 Fesorption agent concentration of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.3.2 解吸劑用量對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

解吸劑用量對吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖4所示。

圖4 解吸劑用量對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.4 Desorption agent of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由圖4可知，隨著解吸劑用量的增多，吳茱萸堿與次堿提取得率也隨之增加，當解吸劑用量增加到5 mL/g時，提取得率基本已趨于平緩。這是由于解吸劑用量太少時，乙醇解吸植物細胞不夠充分，提取活性成分少，當解吸劑用量已足夠潤濕物料，解吸基本達到飽和時，如再繼續(xù)增加解吸劑用量是不經(jīng)濟的，所以本試驗選擇5 mL/g作為解吸劑用量。

2.3.3 解吸時間對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

超聲解吸時間對吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖5所示。

由圖5可知，隨著超聲解吸時間的增多，吳茱萸堿與次堿提取得率也增加，當超聲解吸時間增加到20 min時，提取得率達到最大。當超聲解吸時間20 min時，提取率下降。隨著超聲解吸時間的延長，超聲波的作用也相應(yīng)加強，吳茱萸堿與次堿浸出量增加，但超聲波的空化作用也能使其他物質(zhì)浸出，提取過程中吳茱萸堿與次堿和其他物質(zhì)發(fā)生競爭，所以提取時間大于20 min時吳茱萸堿與吳茱萸次堿的提取率下降，所以本試驗選擇20 min作為超聲解吸劑時間。

圖5 超聲解吸時間對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.5 Ultrasonic desorption time of evodiamine and rutecarpine extraction yield

2.4 減壓提取過程對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.4.1 操作壓力對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

操作壓力對吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖6所示。

圖6 操作壓力對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.6 Operating pressure of evodiamine and rutecarpine extraction yield

由圖6可以看出，操作壓力過低時滲透到內(nèi)部的乙醇達不到沸騰的要求，而壓力過高時沸騰汽化劇烈，因此壓力過低或過高都不適合吳茱萸堿與次堿的提取，當操作壓力為0.04 MPa（絕對壓力）為最適提取條件。這主要是由于解吸過程中，滲透到植物細胞內(nèi)部的乙醇，在該提取壓力下沸騰效果最好，持續(xù)時間最長。所以本試驗選擇0.04 MPa作為減壓操作的工作壓力。

2.4.2 減壓時間對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

減壓時間對吳茱萸堿與次堿得率的影響如圖7所示。

由圖7可知，隨著減壓時間的增加，吳茱萸堿與次堿的提取得率在逐漸增大，在5 min時達到最高，之后隨著提取時間的延長，吳茱萸堿與次堿的提取得率呈現(xiàn)下降的趨勢?？赡苁菚r間過長，引起乙醇沸騰汽化劇烈進而使吳茱萸堿與次堿的提取得率降低，所以本試驗選擇5 min作為減壓操作的工作時間。

圖7 減壓時間對吳茱萸堿和吳茱萸次堿提取率的影響Fig.7 Decompression time of evodiamine and the influence of rutecarpine extraction yield

2.5 正交試驗對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響

2.5.1 吳茱萸堿與次堿提取條件的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為進一步研究解吸劑用量（A）、解吸時間（B）、操作壓力（C）與減壓時間（D）4個因素對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響進行考察，以確定超聲波聯(lián)合減壓-內(nèi)部沸騰法最佳提取工藝條件。本試驗采用L9（34）正交試驗，以吳茱萸堿與次堿提取得率為指標進行正交優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果如表2所示。

表2 吳茱萸堿與次堿正交試驗方案及極差分析結(jié)果Table 2 Evodiamine and rutecarpine orthogonal test and extreme difference analysis results

由表2中極差R來看，正交試驗所考察的4個因素對吳茱萸堿與次堿提取得率的影響基本一致，各因素對吳茱萸堿提取得率的影響較顯著，4個因素對吳茱萸堿得率的影響程度為B＞A＞D＞C，即解吸時間＞解吸劑用量＞減壓時間＞操作壓力，最佳的提取工藝為A3B2C1D3，即在解吸劑用量 6 mL、解吸時間 20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時間6 min時吳茱萸堿與次堿提取得率最高。

2.5.2 正交試驗方差分析

取各列偏差平方和中最小的近似當作誤差的估計，選用因素C操作壓力為誤差估計，方差分析結(jié)果見表3與表4。

表3 吳茱萸堿正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Evodiamine orthogonal test the result of variance analysis

表4 吳茱萸次堿正交試驗方差分析結(jié)果Table 4 Rutecarpine orthogonal test the results of variance analysis

由方差分析結(jié)果可知，因素A、B、D，即解吸劑用量、解吸時間、減壓時間對吳茱萸堿提取得率的影響要大于對吳茱萸次堿提取得率的影響，且解吸劑用量、解吸時間對結(jié)果影響較為顯著，與極差分析結(jié)果基本一致。

2.5.3 驗證試驗

在正交試驗結(jié)果最佳工藝條件下，即解吸劑用量6 mL、解吸時間20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時間6 min條件下時，吳茱萸堿與次堿的提取率最大，并與傳統(tǒng)炮制提取法、超聲波提取法及微波提取法相比較，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗與其他最佳提取方法Table 5 Validation testing and other best extraction method

結(jié)果顯示超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法提取得率明顯高于傳統(tǒng)炮制提取法、超聲波提取法及微波提取法，超聲聯(lián)合減壓內(nèi)部沸騰法提取時間縮短1/2、乙醇溶劑用量減少80%，反應(yīng)條件溫和，提取過程危險性大大降低。

3 結(jié)論

超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取中藥吳茱萸在解吸劑用量6 mL、解吸時間20 min、操作壓力0.03 MPa、減壓時間6 min的條件下，吳茱萸堿的得率為2.54%，吳茱萸次堿的得率為0.87%。與炮制提取法0.72%、0.34%，超聲波提取法1.29%、0.52%，微波提取法0.92%、0.37%相比超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取溫度低、速度快、溶劑消耗量少，大大提高了提取生產(chǎn)過程的安全性，所得提取液質(zhì)量高。超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法用于提取吳茱萸生物堿優(yōu)勢明顯。綜上所述，超聲聯(lián)合內(nèi)部沸騰法提取為吳茱萸藥材的較佳提取方法。