周炳江，李靖，馬長樂，*，張金麗

（1.西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南昆明650224；2.云南省高校園林植物與觀賞園藝重點實驗室，云南昆明650224；3.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650224）

云南榧樹（Torreya yunnanensis）為我國云南省特有植物，屬于第三紀(jì)孑遺植物，且已列為國家二級瀕危保護(hù)植物，現(xiàn)主要分布在云南省的維西、麗江、貢山、中甸等高山地帶[1-3]。云南榧子具有食藥價值，民間常用其種子作中藥材使用，具有殺蟲、消積、潤腸、通便的功效[4]。

目前，國內(nèi)外對云南榧子營養(yǎng)研究較少，馬長樂等[5]對云南榧子和香榧子的油脂、蛋白和礦質(zhì)元素含量進(jìn)行了對比研究，得出云南榧子同樣富含蛋白質(zhì)和礦質(zhì)元素。陳振德等[6]用重量法和氣相色譜法對榧屬植物的油含量及其脂肪酸組成，其結(jié)果表明云南榧子含油率（50.27%）及不飽和脂肪酸（占總脂肪酸76.1%）含量較高。此外，陳正德等[7]還對不同產(chǎn)地云南榧子中多糖進(jìn)行了含量測定分析，云南榧子多糖含量較高及多糖組成較簡單。以往研究中大多對云南榧子的幾類營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行研究，并未全面了解其營養(yǎng)成分，因此利用代謝組學(xué)對其營養(yǎng)價值進(jìn)行全面研究是至關(guān)重要的。

代謝組學(xué)是通過核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）以其與質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）聯(lián)用等技術(shù)手段，采用組學(xué)分析方法，研究不同樣本的所有代謝物差異分析，具有耗時短，準(zhǔn)確度高，廣覆蓋的特點[8-11]。其中廣泛靶向代謝組學(xué)是結(jié)合了非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)的優(yōu)點，基于廣泛靶向代謝組數(shù)據(jù)庫，采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，定性、定量樣本中代謝物檢測方法，具有高效、高靈敏、高覆蓋的特點[12-13]。因此，可利用代謝組學(xué)對食品進(jìn)行代謝產(chǎn)物的鑒定與分析，有助于全面了解食品的營養(yǎng)價值[14-15]。

本研究為全面了解云南榧子營養(yǎng)成分，促進(jìn)云南榧子營養(yǎng)價值的開發(fā)，以野生云南榧子作為研究對象，利用廣泛靶向代謝組學(xué)分析方法與超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對云南榧子代謝物進(jìn)行成分鑒定與分析，為云南榧樹的種植推廣和保護(hù)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Shim-pack超高效液相色譜：日本島津公司；6500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜：美國Applied Biosystems公司；MM 400研磨儀：德國Retsch公司。甲醇、乙腈、乙醇（色譜純）：德國Mark公司。云南榧子于2017年9采自云南省迪慶州維西縣（海拔2 190 m），選取飽滿無壞的種子進(jìn)行晾干處理，于室溫（15℃～25℃）下貯藏備用。

1.2 方法

將云南榧子于真空冷凍干燥，用研磨儀研磨（30Hz）1.5 min，直至粉末狀；準(zhǔn)確稱取100 mg的粉末，溶解于1.0 mL 70%甲醇水中，在4℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率；10 000 g離心10 min后，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，于進(jìn)樣瓶保存，用于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.1 液相條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流動相：水相為超純水（加入0.04%的乙酸），有機(jī)相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0 min水/乙腈（95∶5，體積比），11.0 min為5∶95體積比，12.0 min為5∶95體積比，12.1 min為95∶5體積比，15.0 min為95∶5體積比；流速0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 2 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓 5 500 V，簾氣（curtain gas，CUR）25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（collision-activated dissociation，CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（triple quadrupole，QQQ）中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進(jìn)行掃描檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)控樣本：質(zhì)控樣本（quality control samples，QC）由3組云南榧子提取物等量混合制備而成，3個重復(fù)，與分析樣本采用相同的方法處理和檢測。在儀器分析的過程中，每10個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

定性分析：基于武漢邁特維爾生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫（MetWare數(shù)據(jù)庫V3.3）及代謝物公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)二級譜信息對代謝物定性。

半定量分析：利用三重四級桿質(zhì)譜的MRM分析完成定量，采用峰面積歸一法計算個代謝物成分相對百分含量。

相對含量/%=M/N×100

式中：M為代謝物的峰面積；N為總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本質(zhì)控結(jié)果

通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對云南榧子代謝物進(jìn)行分析，得到總離子流圖見圖1?？傠x子流的曲線峰值保留時間和峰強(qiáng)度基本一致。這表明質(zhì)譜對同一樣品的不同時間檢測時，信號較為穩(wěn)定。說明此方法對云南榧子測定出的代謝物數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。

2.2 代謝物成分組成

云南榧子共檢測鑒定出440種代謝物，按其特性共分為8類見圖2、表1。

圖1 QC樣本質(zhì)譜檢測總離子流圖的疊加圖Fig.1 Overlap total ion of quality control samples

圖2 云南榧子物質(zhì)的相對含量與數(shù)量Fig.2 Relative content and quantity of material seed of Torreya yunnanensis

表1 云南榧子代謝物成分列表Table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

續(xù)表1 云南榧子代謝物成分列表Continue table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

由圖2可知，其中有機(jī)酸類121種，占總含量的33.75%；氨基酸類93種，占總含量的15.95%；脂類57種，占總含量的12.95%；其他類42種，占總含量的12.85%；核苷酸類60種，占總含量的11.05%；醇類20種，占總含量的6.19%；維生素類16種，占總含量的4.36%；糖類20種，占總含量的2.87%；吲哚類11種，占總含量的0.97%。

由表1可知，占總量1%以上的代謝物分別有：有機(jī)酸類9種：甲基蘋果酸（3.898 8%）、磷酸（3.642 1%）、木糖酸（2.764 4%）、甲基丙二酸（2.582 3%）、琥珀酸（2.543 5%）、沒食子酸甲酯（2.253 9%）、D-半乳糖醛酸（2.185 2%）、2-吡啶甲酸（1.3464%）、3，5-二羥基-3-甲基戊酸（1.131 4%）；核苷酸類3種：鳥苷（1.788 2%）、尿嘧啶（1.755 3%）、6-甲基巰嘌呤（1.370 2%）；氨基酸類5種：L-纈氨酸（1.886 7%）、DL-正纈氨酸（1.713 6%）、L-異亮氨酸（1.241 9%）、L-亮氨酸（1.218 0%）、DL-脯氨酸（1.134 4%）；脂類2種：溶血磷脂酰膽堿20：4（2.588 2%）、溶血磷脂酰膽堿 18：0（2.143 4%）；醇類2種，2-癸醇（1.9385%）；1-癸醇（1.8718%）；糖類1種：肌醇半乳糖苷（1.1792%）；維生素類1種：吡哆素（VB6，1.349 4%）；其它物質(zhì)1種：4-硝基苯酚（8.985 7%）。

2.3 營養(yǎng)物質(zhì)成分分析

從檢測結(jié)果得知（圖2，表1），在云南榧子中物質(zhì)相對含量與種類最多的為有機(jī)酸類，其次為氨基酸類?；A(chǔ)氨基酸中僅甘氨酸未被測出，占氨基酸類的39.92%，其中組成甘氨酸的抗氧化劑與還原性谷胱甘肽分別占氨基酸類的0.31%和0.10%。氨基酸類主要成分為L-纈氨酸（11.83%）、DL-正纈氨酸（10.75%）。L-纈氨酸是人體必需氨基酸之一，缺乏時會引起神經(jīng)障礙、發(fā)育停止、體重下降、貧血等及其他一系列生理問題，同時L-纈氨酸也可作營養(yǎng)增補(bǔ)劑、配制復(fù)合氨基酸輸液、食品添加劑等[16]。此外，F(xiàn)值是支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）與芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）的物質(zhì)含量比值，高F值具有輔助治療肝性腦病、保肝、護(hù)肝、治療苯丙酮尿癥、抗疲勞、防衰老等作用，正常人血液的F值在3.5%～4.0%，肝病病人的F值低于2.5%，而云南榧子的F值為5.73%，對于肝病病人有著重要的食用價值[17]。云南榧子中的氨基酸類總量高，種類全，具有較高的營養(yǎng)價值，必需氨基酸占氨基酸類的33.15%，使人體易于吸收利用。一般在研究營養(yǎng)物質(zhì)時，主要研究L-型氨基酸。在本研究中采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，檢測出D、DL型的氨基酸與非基礎(chǔ)氨基酸，這些氨基酸同樣具有豐富的營養(yǎng)功能[18]。

云南榧子脂類含量豐富，主要為磷脂類和脂肪酸類。磷脂不僅有較高的營養(yǎng)價值，同時還具有促進(jìn)人體新陳代謝、預(yù)防疾病、增強(qiáng)免疫力等作用[19]。檢測結(jié)果顯示，云南榧子中的溶血磷脂酰膽堿共鑒定出20種，可作為食品添加劑、抑菌劑和乳化劑，在醫(yī)療及免疫學(xué)方面的研究意義重大[20-21]。此外，還鑒定出14種脂肪酸，其含量占脂類的19.28%。云南榧子的脂肪酸中含12種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸含量占脂類的19.02%，占脂肪酸的98.69%，比陳振德等[6]所報道的76.1%還要高，可能是飽和脂肪酸的山俞酸和棕櫚酸未被檢測出來。本研究中，不飽和脂肪酸主要種類（占總脂肪酸）有十八碳-9E，13E，15Z-三烯酸（30.02%）、石榴酸（27.45%）、順-11-二十碳烯酸（12.69%）、α-亞麻酸（7.79%）、亞油酸（0.23%）等；其飽和脂肪酸有2種，占總脂類的0.26%，占總脂肪酸0.26%，主要種類（占總脂肪酸）有花生酸（0.30%）、木蠟酸（1.02%）。云南榧子的不飽和脂肪酸含量較高，其不飽和脂肪酸是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在人體內(nèi)起至關(guān)重要的作用，一旦缺少就會導(dǎo)致各種疾病的產(chǎn)生。它具有調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇、降低高血壓、抗腫瘤、預(yù)防癌癥等功效[22-23]，其中石榴酸具有防治高血脂癥、心腦血管疾病、抗腫瘤等效果[24]。

鑒定結(jié)果顯示，云南榧子鑒定出的維生素類含量最多的為B族維生素（7種，占維生素類的87.66%），其中含量最高的是維生素B6，占維生素類的30.93%。B族維生素與維生素C（占維生素類的0.73%）為水溶性維生素，水溶性維生素具有改善患者心臟功能、改善睡眠的作用，為常見營養(yǎng)強(qiáng)化劑[25-27]。在云南榧子的糖類中肌醇半乳糖苷相對含量最高，占鑒定出的糖類的41.11%，是構(gòu)成保護(hù)植物免受氧化損傷成分之一[28]，并能通過棉籽合酶的作用，與蔗糖轉(zhuǎn)化成低聚糖棉子糖[29]，在食品有著非常重要的作用。

鑒定結(jié)果進(jìn)一步顯示，除前面常見營養(yǎng)物質(zhì)外，云南榧子中有機(jī)酸種類豐富而使其具有獨特的風(fēng)味。云南榧子鑒定出的有機(jī)酸中相對含量最高的香味物質(zhì)為香蘭素（占有機(jī)酸類2.76%），具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，用途十分廣泛，被稱為“食品香料之王”[30]；同時醇類物質(zhì)也是云南榧子香味的重要來源之一，1-癸醇（占醇類30.24%）具甜的玫瑰脂蠟香，略有甜橙花、鈴蘭花氣息[31]。

3 結(jié)論

本研究以野生的云南榧子為研究對象，利用廣泛代謝組學(xué)技術(shù)對云南榧子進(jìn)行營養(yǎng)價值的評價，總共鑒定出440種代謝物。其中有機(jī)酸類的相對含量與數(shù)量最高，共121種，占總含量的33.75%，其次為氨基酸類93種（15.95%）；脂類 57種（12.95%），位于第三大類，其必需氨基酸含量較高，占氨基酸類的33.15%；脂肪酸占脂類的19.27%，不飽和脂肪酸占脂肪酸的98.69%；維生素類16種，占總含量的4.36%，其水溶性維生素（B族維生素與維生素C）占維生素類的88.39%；糖類有20種，占總含量2.87%，這些營養(yǎng)物質(zhì)種類豐富，使云南榧子擁有豐富的營養(yǎng)；云南榧子中香蘭素與1-葵醇含量較高，分別占有機(jī)酸類與醇類的2.76%、30.24%，可能是組成云南榧子獨特的風(fēng)味重要因素之一。

此次試驗，微量元素雖未測定，但在科研組[5]前期測定的結(jié)果來看，云南榧子富含礦質(zhì)元素，為典型的高鉀低鈉食品。以上這些結(jié)果都表明云南榧子的營養(yǎng)物質(zhì)豐富，云南榧子是很好的野生食用植物資源，可加工成零食干果，未來可進(jìn)一步推動其自然野生資源的開發(fā)利用與保護(hù)。