唐婷范，黃芳麗，朱家慶，程昊，黃青勇，李曉慧，梁杰婷，田玉紅，*

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州545006）

葛根（Pueraria lobata）又名野葛，是多年生落葉藤本豆科植物。我國擁有豐富的葛根資源，栽培種類繁多，種植歷史悠久[1]。葛根含有豐富的活性成分，異黃酮是葛根的主要活性成分，約占葛根總量的5%～10%[2]，其具有改善血液循環(huán)、降低血壓、軟化血管、增強(qiáng)血液循環(huán)功能、預(yù)防癌癥等功效，臨床上用于治療心絞痛、高血壓、偏頭痛等[3-4]。在食品工業(yè)、日用、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的作用，因此進(jìn)行葛根的異黃酮提取工藝優(yōu)化及其抑菌作用研究具有重要意義[5-7]。目前最常用的提取葛根異黃酮的方法是乙醇加熱回流法，但該法加熱時間長，雜質(zhì)溶出物較多，與乙醇加熱回流提取法相比，超聲波輔助提取法具有工藝簡單、無需加熱、提取快速、提取率高等特點(diǎn)。超聲技術(shù)已廣泛地得到應(yīng)用，很多研究表明，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動、高的加速度、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、攪拌作用等，可加速植物材料中的有效成分進(jìn)入溶劑，從而增加有效成分的提取率，縮短提取時間，并且還可避免高溫對提取成分的影響[8-13]。

為克服傳統(tǒng)提取法加熱時間長雜質(zhì)溶出物較多等缺點(diǎn)，本試驗(yàn)以葛根為原材料，采用超聲波輔助法提葛根取異黃酮，考察乙醇濃度、超聲功率、提取溫度、液料比以及提取時間對異黃酮提取得率的影響；并選用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化異黃酮提取工藝，以期確定超聲波輔助提取葛根異黃酮的最佳工藝條件。同時采用4種不同的菌對所提取的異黃酮進(jìn)行初步的抑菌研究，旨在為更好地開發(fā)利用葛根資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根，選用廣西貴港野葛；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、黑曲霉：廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院提供；無水乙醇為分析純；葛根素為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-GF101-4-S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；DFY-600C型搖擺式高速粉碎機(jī)：浙江省溫嶺市大機(jī)械有限公司；TU-1950型紫外-可見光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；TDL-80-2B型低速臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；AR124CN型電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHZ-95B型循環(huán)水式真空抽濾機(jī)：河南予華儀器有限公司；RE-52A型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；RE-52AZSD-1270型立式壓力蒸汽滅菌器：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250-A型生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 葛根異黃酮的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 葛根的預(yù)處理

選擇新鮮無蟲害品質(zhì)良好的野葛根，將其清洗干凈，去皮，切片，然后用烘箱低溫（40℃）烘干；烘干好的葛根用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎、過40目篩，然后將粉末密封保存，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用95%乙醇溶解后，用25 mL容量瓶定容，搖勻，得到0.2 mg/mL葛根標(biāo)準(zhǔn)液。分別移取5.0 mL離心后的葛根提取液和2.0 mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL具塞試管中，用95%的乙醇定容到刻度，搖勻，以95%乙醇為空白，用紫外-可見光光度計(jì)在200 nm～500 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定吸收波長。分別精密吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL 葛根標(biāo)準(zhǔn)溶液于 25 mL 容量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻。用紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行測定吸光值。以葛根素濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光值（A）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

2.1.3 葛根異黃酮的測定

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理好的葛根粉，置于150 mL帶塞錐形瓶中按一定的液料比加入不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行溶解，充分溶解后放入超聲波清洗機(jī)中，在一定的溫度、超聲功率下超聲波輔助提取一定時間，提取完成后趁熱進(jìn)行真空抽濾，然后吸取10mL濾液到100mL容量瓶中，用95%的乙醇定容到刻度線，搖勻，用離心機(jī)以3 000 r/min離心10 min，從上清液中吸取2.5 mL到50 mL容量瓶中，并用95%的乙醇稀釋到刻度。然后在波長250 nm處進(jìn)行異黃酮的測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出異黃酮的含量，并按公式1計(jì)算出異黃酮的得率。

式中：C為提取液異黃酮的濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；m為提取樣質(zhì)量，g。

2.1.4 單因素試驗(yàn)

2.1.4.1 乙醇濃度的考察

準(zhǔn)確稱2 g預(yù)處理好的葛根粉，在超聲功率300W、提取溫度50℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間30 min的條件下，取乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%和90%6個水平進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，每個水平做3個平行。

2.1.4.2 超聲功率的考察

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理好的葛根粉，在乙醇濃度為60%、提取溫度 50℃、液料比 20∶1（mL/g）、提取時間30 min 的條件下，取超聲功率為 200、250、300、350、400 W 5個水平進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，每個水平做3個平行。

2.1.4.3 提取溫度的考察

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理好的葛根粉，在乙醇濃度為60%、超聲功率 300 W、液料比 20∶1（mL/g）、提取時間30 min 的條件下，取溫度為 30、40、50、60、70 ℃ 5 個水平進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，每個水平做3個平行。

2.1.4.4 液料比的考察

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理好的葛根粉，在乙醇濃度為60%、超聲功率300 W、提取溫度50℃、提取時間30 min 的條件下，取液料比為 10∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1、30∶1（mL/g）5個水平進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，每個水平做3個平行。

2.1.4.5 提取時間的考察

準(zhǔn)確稱取2 g預(yù)處理好的葛根粉，在乙醇濃度為60%、超聲功率300 W、提取溫度50℃、液料比20 ∶1（mL/g）的條件下，取提取時間為 10、20、30、40、50、60、70、80 min 8個水平進(jìn)行超聲波輔助提取試驗(yàn)，每個水平做3個平行。

2.1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）3個因素為自變量，以異黃酮得率為指標(biāo)，結(jié)合 Design Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken設(shè)計(jì)法[15-17]，建立三因素三水平上響應(yīng)面試驗(yàn)，對超聲提取異黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素及水平見下表1，其中1、0、-1分別代表自變量中的高水平、中水平和低水平。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factor level and coded of Box-Behnken design

2.2 抑菌試驗(yàn)

2.2.1 原料異黃酮的制備

稱取經(jīng)預(yù)處理后葛根粉200.0 g，進(jìn)行提取后，用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾，過濾所得濾液再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃蒸發(fā)濃縮，最后用干燥箱在60℃下干燥所得。

2.2.2 抑菌試驗(yàn)方法

將葛根異黃酮配成 0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 溶液，采用濾紙片法[18]：以無菌水做空白對照，5%苯甲酸鈉為陽性對照，分別放入直徑6 mm的無菌濾紙片浸泡2 h，取出濾紙片瀝干表面水分。在無菌環(huán)境下將培養(yǎng)基冷卻至40℃～50℃后倒入各滅菌好的平板中，每平板約20 mL，靜置冷卻至凝固。將4種活化好的菌懸液（細(xì)菌菌落數(shù)約為107CFU/mL～108CFU/mL[19]，霉菌孢子數(shù)約為106個/mL～107個/mL）。分別用移液槍吸取0.1 mL放到不同的培養(yǎng)基上，用滅菌過的玻璃涂棒涂布均勻，并對其進(jìn)行編號區(qū)分。用鑷子夾取5種浸泡后瀝干的濾紙片放置在4種含菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放3片，呈三角形排布，每次夾取濾紙片前鑷子要經(jīng)火焰灼燒滅菌。處理好后的培養(yǎng)皿放到適宜的環(huán)境下培養(yǎng)：細(xì)菌在37℃條件下培養(yǎng)18 h～24 h、霉菌在28℃條件下培養(yǎng)48 h。取出測量各個抑菌圈的直徑，記錄并判斷不同濃度對不同菌種的抑制效果。

2.3 數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)重復(fù)測定3次，取平均值。使用Origin 8進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄、初步處理和繪制圖表；采用spss 17軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Design Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Bnheken試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 葛根異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

葛根異黃酮與葛根素的紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 葛根異黃酮與葛根素的紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Pueraria isoflavones and Puerarin

由圖1表明，在波長250 nm處葛根異黃酮和葛根素標(biāo)準(zhǔn)液的均有最大吸收峰，故試驗(yàn)選定的測定波長為250 nm。在250 nm處測量吸光值，以葛根素濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Puerarin

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.067 x-0.004 5（R2=0.999 3），葛根素在 1.6 μg/mL～12 μg/mL 濃度范圍內(nèi)濃度和吸光度有良好的線性關(guān)系。

精準(zhǔn)移取25 mL同一樣品溶液5份，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 葛根素標(biāo)準(zhǔn)液，在波長 250 nm處測定各樣液的吸光度，根據(jù)回收率=（實(shí)際測值-樣液異黃酮含量）/葛根素加入量×100%計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of recovery experiments（n=5）

由表2得知，平均加標(biāo)回收率為98.73%，RSD為2.04%，表明此方法可用于測定葛根異黃酮的含量。

3.2 單因素對葛根異黃酮提取得率的影響

3.2.1 乙醇濃度對葛根異黃酮提取得率的影響

乙醇濃度對異黃酮提取得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對異黃酮提取得率的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on extraction of isoflavones

由圖3可知，葛根異黃酮得率隨著乙醇濃度的增大先升高后降低，在乙醇濃度為60%時提取得率最大，形成此趨勢主要是葛根含有的異黃酮種類非常多，多數(shù)異黃酮不易溶于水，而且不同的異黃酮單體之間極性不同[20]。故最佳的乙醇濃度為60%。

3.2.2 超聲功率對葛根異黃酮提取得率的影響

超聲功率對異黃酮提取得率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對異黃酮提取得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on extraction of isoflavones

由圖4可知，葛根異黃酮得率隨著超聲功率增加而增加，當(dāng)提取功率大于300 W時異黃酮得率開始緩慢下降。可能原因是功率較大時，超聲波及剪切力作用下，使葛根異黃酮的結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成異黃酮得率下降[21-22]。故本試驗(yàn)選擇超聲功率300 W為研究對象。

3.2.3 提取溫度對葛根異黃酮提取得率的影響

提取溫度對異黃酮提取得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對異黃酮提取得率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic temperature on extraction of isoflavones

由圖5可以看出，在溫度50℃前葛根異黃酮提取得率隨溫度升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到50℃以后，異黃酮得率開始下降，原因可能是高溫時會破壞異黃酮母核的結(jié)構(gòu)，從而提取得率下降[23]。因此提取溫度選50℃為宜。

3.2.4 液料比對葛根異黃酮提取得率的影響

液料比對異黃酮提取得率的影響見圖6。

圖6 液料比對異黃酮提取得率的影響Fig.6 Effects of ratio of solid to liquid on extraction of isoflavones

由圖6可知，隨著液料比的增大異黃酮得率先升高后下降，在液料比20∶1（mL/g）時異黃酮得率出現(xiàn)最大值?？赡茉蚴侨軇┝康脑黾邮乖项w粒周圍有效成分的濃度降低，從而有利于異黃酮向提取液擴(kuò)散，但液料比太大，溶劑揮發(fā)增加了異黃酮的損失，同時也提高雜質(zhì)成分的溶出，導(dǎo)致異黃酮提取得率下降[24]。故液料比選 20 ∶1（mL/g）最佳。

3.2.5 提取時間對葛根總異黃酮提取效果的影響

提取時間對異黃酮提取得率的影響見圖7。

圖7 提取時間對異黃酮提取得率的影響Fig.7 Effects of ultrasonic extraction time on extraction of isoflavones

由圖7可知，在前60 min內(nèi)異黃酮得率隨著提取時間的增加而增高，之后明顯趨緩甚至下降，可能的原因是異黃酮類物質(zhì)長期處于高溫環(huán)境下容易被氧化[22]，并且長時間提取會溶出大量的非異黃酮雜質(zhì)[25]。故選擇提時間以60 min為宜。

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取葛根異黃酮的工藝條件

3.3.1 異黃酮提取工藝回歸模型的建立及方差分析

Design Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken建立的17個試驗(yàn)方案按2.1.5方法進(jìn)行試驗(yàn)分析，設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Box-Behnken design matrix and response value for the yield of isoflavones

應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件，對表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系，得出異黃酮得率（Y）與液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=2.12＋0.010A-0.020B-0.010C-0.010AB＋0.015AC＋0.000BC-0.089A2-0.086B2-0.066C2。對所建的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA for the response surface quadratic isoflavones model

由表4可知，所建立的模型具有極高顯著性（P＜0.000 1），一次項(xiàng) B 具有顯著性，二次項(xiàng) A2、B2、C2極顯著，其余項(xiàng)均不顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.774 4），由F值知，各因素對葛根異黃酮得率的影響主次順序?yàn)椋阂掖紳舛龋˙）＞液料比（A）＞提取溫度（C），模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.986 1，校正確定系數(shù)Radj2=0.968 3，說明回歸方程的擬合度有較高的可信度，誤差小，可用此模型對葛根異黃酮提取進(jìn)行預(yù)測和分析。

3.3.2 異黃酮得率響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件，繪制出交互作用AB、AC、BC的3D曲面圖，可以直觀看出3個因素和響應(yīng)值之間的交互影響情況，結(jié)果如圖8～圖10所示。響應(yīng)曲面坡度陡峭，說明響應(yīng)值容易受到影響，坡度平緩，說明其響應(yīng)值不容易受到影響[26]。

由圖8可知，曲面坡度相對陡，說明料液比和乙醇濃度的交互影響顯著。同理由圖9和圖10可知，它們的曲面坡度相對也陡，說明料液比和提取溫度、乙醇濃度和提取溫度的交互影響顯著。

3.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證分析

圖8 液料比和乙醇濃度對異黃酮得率的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of the ratio of liquid to solid and the ethanol concentration to the yield of isoflavones

圖9 液料比和提取溫度對異黃酮得率的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface diagram of the ratio of liquid to solid and the temperature on extraction to the yield of isoflavones

圖10 乙醇濃度和提取溫度對異黃酮得率的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface diagram of the ethanol concentration and the temperature on extraction to the yield of isoflavones

根據(jù)模型進(jìn)一步回歸分析，預(yù)測出的最佳的提取工藝參數(shù)：液料比為20.30∶1（mL/g）、乙醇濃度為58.81%、提取溫度為49.34℃，此條件下異黃酮得率理論值為2.12%?？紤]到實(shí)際操作，將提取異黃酮工藝參數(shù)修正為：液料比為20∶1（mL/g）、乙醇濃度為60%、提取溫度為50℃。按照此修正工藝參數(shù)進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，得出平均得率為2.11%，與理論值相對誤差為0.47%，說明此工藝穩(wěn)定可行。

3.4 葛根異黃酮抑菌效果

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和青霉對不同濃度的葛根異黃酮的抑菌效果見表5。

表5 不同濃度葛根異黃酮的抑菌效果Table 5 Antibacterial effects of different concentrations of isoflavones

從表5可以看出葛根異黃酮對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有不同程度的抑制效果，異黃酮濃度在0.5mg/mL時對大腸桿菌開始有抑菌作用，異黃酮濃度在1.0 mg/mL時對枯草芽孢桿菌開始有抑菌作用。在一定濃度范圍內(nèi)隨著葛根異黃酮的濃度增加抑菌效果更明顯，在同一濃度中大腸桿菌抑菌效果大于枯草芽孢桿菌的抑菌效果；而對青霉和黑曲霉則無抑菌效果。

4 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化葛根異黃酮提取條件，得出超聲波輔助法提取異黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，超聲功率300 W，提取溫度50 ℃，液料比 20 ∶1（mL/g），提取時間 60 min，在此條件下異黃酮提取得率可達(dá)2.11%，理論值相對誤差為0.47%，且各因素對異黃酮提取得率的影響依次為：乙醇濃度（B）＞液料比（A）＞提取溫度（C），模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.986 1，此提取工藝條件合理可行。與傳統(tǒng)提取工藝相比，該提取工藝時間短。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取的葛根異黃酮對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌有一定抑菌效果，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑菌作用隨濃度增大而增強(qiáng)，說明葛根異黃酮是一種具有抑菌活性的物質(zhì)，可作為一種天然的防腐劑。