呂丁陽，殷麗君，陳復(fù)生，*，段曉杰

（1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京100083）

乳化劑是一種通過降低兩個不混溶相間界面張力進而促進乳狀液形成的表面活性劑[1]。食品乳化劑是食品工業(yè)中用量較多的添加劑之一，按照來源可分為天然型和人工合成型[2]，目前熱點集中于利用天然乳化劑代替合成型乳化劑[3]。天然乳化劑多從植物中提取，如多糖類[4]、蛋白質(zhì)類[5]。多糖類乳化劑通常缺少與其親水基團相匹配的疏水性基團[6]，蛋白質(zhì)類乳化劑易受環(huán)境影響[7]，為了改善多糖與蛋白質(zhì)的乳化特性，研究人員利用物理化學方法使多糖與蛋白質(zhì)交聯(lián)從而制得多糖-蛋白質(zhì)共聚物，聚合物能夠集合兩者的優(yōu)良特性[8]。近些年多糖與蛋白質(zhì)之間的酶促交聯(lián)反應(yīng)因反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間較短且結(jié)合產(chǎn)物無毒性逐漸成為研究熱點[9]。

多糖與蛋白質(zhì)的酶促交聯(lián)反應(yīng)通常通過過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、漆酶等實現(xiàn)。HRP與漆酶主要作用于多糖中的阿魏酸與蛋白質(zhì)中的酪氨酸，使二者交聯(lián)進而使多糖與蛋白質(zhì)形成共聚物[10]。在H2O2、蛋白質(zhì)存在條件下，HRP催化多糖氧化交聯(lián)反應(yīng)的機理為HRP將蛋白質(zhì)中的酚氧化成鄰醌，醌在多糖的分子內(nèi)交聯(lián)副反應(yīng)中形成二聚體，或與多肽的氨基或巰基側(cè)鏈反應(yīng)形成共價C-N或C-S鍵，并再次形成酚羥基結(jié)構(gòu)，后者可以再次被氧化并結(jié)合從而形成交聯(lián)化合物。所以在HRP的催化下，多糖和蛋白質(zhì)也會通過阿魏酸及酪氨酸的自身交聯(lián)形成多糖-多糖及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)酶促共聚物[11-12]。

我國是小麥生產(chǎn)大國，每年因小麥制粉產(chǎn)生約2 000萬t麥麩，大部分麥麩均用作飼料，造成極大的資源浪費[13]。近些年來，國內(nèi)外研究人員對麥麩中含有的膳食纖維、蛋白等進行深入研究，表明從麥麩中提取的阿拉伯木聚糖在食品乳化劑、化妝品等行業(yè)具有應(yīng)用前景[14]。阿拉伯木聚糖由一系列β-D-吡喃木糖殘基通過β-1，4-糖苷鍵連接成主鏈，α-L-阿拉伯呋喃糖在α-L-阿拉伯呋喃糖上不取代、C2（C3）位置單取代或C2和C3位置上雙取代[15-16]。阿拉伯木聚糖還存在羥基氨基酸殘基，主要是阿魏酸和一些對香豆酸，酯化在α-L-阿拉伯呋喃糖殘基的C（O）-5上[17]。阿拉伯木聚糖分子量大，且富含羥基，通常通過改善乳狀液的流變學特性進而改善乳狀液穩(wěn)定性，但是阿拉伯木聚糖通常缺少與親水基團相對應(yīng)的疏水性基團，應(yīng)用在乳狀液中時乳化活性較差[18]。

本文利用HRP催化麥麩阿拉伯木聚糖（wheat bran arabinoxylan，WBAX） 與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）第五組分交聯(lián)，通過紫外分光光度法采用單因素試驗確定交聯(lián)反應(yīng)的最適HRP酶添加量、H2O2濃度、WBAX與BSA質(zhì)量比，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）及高效尺寸排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）對WBAX-BSA酶促共聚物進行定性分析，并研究了在3個因素下WBAX-BSA酶促共聚物乳化活性及乳化穩(wěn)定性變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

WBAX（其中阿拉伯木聚糖含量為71%）：河南工業(yè)大學糧油食品學院8351實驗室自提；BSA第五組分、HRP（200 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；H2O2（30%）：天津科密歐化學試劑有限公司；疊氮化鈉：天津化工試劑三廠；無水乙醇（色譜級）：天津市津科精細化工；其他試劑均為分析級。

UV-1901紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；DYY-6D電泳設(shè)備：北京市六一儀器廠；BS210S分析天平：德國Sartorius公司；LGL-25C冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠；GL-20C高速離心機：上海安亭科學儀器有限公司；FLUKO高速剪切均質(zhì)機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；dRI-rEX-495示差檢測器：美國Wyatt科技公司。

1.2 WBAX-BSA酶促共聚物制備

分別利用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5）配置濃度分別為 0.05、0.1、0.2、0.4、1.0%的 WBAX、0.4%BSA，100 U/mL HRP 溶液，濃度為 0.05、0.5、1.0、5.0、10.0 mol/L的H2O2。取適宜體積的上述HRP溶液、50 μL適宜濃度的H2O2、1mL BSA混合，然后將4 mL各濃度的WBAX分成體積相同的10份，每隔5 min以400 μL體積添加到上述混合溶液中，配置成不同WBAX 與 BSA質(zhì)量比（1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、10∶1、15 ∶1）的溶液。對照組為單獨的WBAX、BSA溶液及不含有HRP的WBAX/BSA復(fù)合物及HRP催化的WBAX（1.0%）或BSA（0.4%），分別記作 WBAX、BSA、WBAX/BSA 復(fù)合物、WBAX（HRP）、BSA（HRP）。試驗組及對照組放置于35℃恒溫振蕩水浴鍋中反應(yīng)4 h，然后利用20 μL 1.0%疊氮化鈉終止反應(yīng)。

1.3 紫外-可見光吸收光譜分析

當WBAX與BSA在HRP的作用下發(fā)生反應(yīng)時，WBAX結(jié)構(gòu)中含有的阿魏酸及BSA含有的酪氨酸含量會降低，據(jù)Oudgenoeg G等報道[19]，阿魏酸及酪氨酸分別在325、280 nm處具有最大紫外吸收光值?？梢酝ㄟ^監(jiān)測各樣品在325、280 nm處紫外吸收光度值的變化監(jiān)測酶促反應(yīng)進程。取1.2制備的樣品利用0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖溶液稀釋一倍，以磷酸鹽緩沖溶液為標定液，測定各樣品在325 nm（阿魏酸）及280 nm（酪氨酸）處的吸光度值[20]。

1.4 乳化性測定

取30 mL制備好的樣品溶液于平底小燒杯中，加入10 mL大豆油，在10 000 r/min下均質(zhì)1 min，分別于0、10 min從燒杯底部0.5 cm處取50 μL勻漿液稀釋在5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，混勻后在500 nm波長處測定吸光值分別記作A0和A10。用0.1%SDS溶液作為空白對照。根據(jù)公式（1）、（2）計算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）[21]。

式中：N為稀釋倍數(shù)，100；θ為油相體積比，0.25；L 為比色杯厚度，1 cm；C 為蛋白質(zhì)濃度；A0、A10分別為0 min和10 min的吸光值；10為兩次測定的時間間隔，min。

1.5 SDS-PAGE分析

分別將 10 μL 樣品溶液 [WBAX、BSA、WBAX（HRP）、BSA（HRP）、WBAX/BSA 酶促共聚物、WBAX/BSA復(fù)合物]與10 μL樣品緩沖液混合，樣品緩沖液由 25%甘油、60 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、2%SDS、14.4 mmol/L β-巰基乙醇、0.1%溴酚藍和50 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）組成。樣品緩沖液混合物煮沸3 min，取10 μL上樣，電泳凝膠由5%濃縮膠和12%分離膠組成，在恒流條件下進行，其中濃縮膠電流為20 mA，分離膠電流為40 mA。凝膠電泳結(jié)束后進行振蕩染色1 h，脫色處理1 h，蛋白質(zhì)染色液配方為1.0 g考馬斯亮藍R250、45%甲醇、45%蒸餾水、10%甲酸；脫色液配方10%甲醇、80%蒸餾水、10%甲酸。

1.6 HPSEC分析

在25℃條件下，將待測樣品溶液利用0.45 μm微濾膜過濾。采用1200 HPLC液相系統(tǒng)，配置體積排阻色譜柱TSK Gel 5000 PWXL，柱溫35℃，檢測器為示差檢測器，流動相為0.2 mol/L NaCl溶液，流速0.5 mL/min。樣品溶液上樣量為20μL，等度洗脫，洗脫時間為40min，每個樣品測定3次取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 各因素對WBAX-BSA酶促共聚物吸光度及乳化特性影響研究

2.1.1 酶添加量對性質(zhì)的影響結(jié)果

當H2O2濃度為0.5 mol/L，WBAX與BSA質(zhì)量比為10∶1時，測定反應(yīng)體系中不同酶添加量（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/g） 對 WBAX-BSA 酶促共聚物 Abs及乳化特性影響。其中酶添加量是指每克底物中添加的酶活力，試驗結(jié)果見圖1及圖2。

圖1 酶添加量對WBAX-BSA酶促共聚物Abs變化影響Fig.1 Effect of enzyme addition on the Abs change of WBAX-BSA conjugates

圖2 酶添加量對WBAX-BSA的ESI/EAI的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the ESI/EAI of WBAX-BSA conjugates

當WBAX中含有的阿魏酸或BSA中含有的酪氨酸在HRP的催化下發(fā)生反應(yīng)時，反應(yīng)體系中阿魏酸或酪氨酸的含量會降低，相對應(yīng)的Abs325nm、Abs280nm會減小[22]。由圖1可知，酶添加量為0.1 U/g～0.5 U/g均可以催化WBAX與BSA交聯(lián)。與未添加HRP的WBAX/BSA復(fù)合物體系相比，HRP添加量為0.2 U/g時，Abs325nm、Abs280nm變化最顯著，其中Abs325nm下降了28.6%，Abs280nm下降16.6%，隨后提高HRP濃度，Abs325nm及Abs280nm沒有顯著降低，表明當酶添加量為0.2 U/g時足以促進WBAX與BSA發(fā)生反應(yīng)。

從圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，WBAXBSA的EAI及ESI呈現(xiàn)先增加后趨于平緩的趨勢，當WBAX與BSA體系中加入0.2 U/g的HRP時，EAI由161.4 m2/g提升至211.4 m2/g，提升了30.9%；ESI由18.7 min提升至32.4 min，提升了73.2%。且隨著酶添加量的增加，EAI及ESI趨于平穩(wěn)。這是因為當WBAX與BSA通過HRP交聯(lián)后運用到乳狀液中時，WBAXBSA酶促共聚物能夠遷移到油水界面處，WBAX能夠增加乳狀液黏度，BSA具有分子兩親性，能夠吸附在油水界面，降低油水界面張力，從而提升乳狀液EAI及ESI[23]，隨著酶添加量增加，EAI及ESI趨于平穩(wěn)，這與WBAX、BSA的Abs325nm及 Abs280nm變化呈現(xiàn)一致性，說明反應(yīng)體系中酶添加量為0.2 U/g時，WBAX與BSA交聯(lián)度較好、乳化穩(wěn)定性及乳化活性較高，且酶添加量的繼續(xù)增加不會顯著增加WBAX與BSA的交聯(lián)度及乳化特性。

2.1.2 H2O2濃度對性質(zhì)的影響結(jié)果

HRP需要在H2O2的作用下釋放酶活力催化WBAX與BSA反應(yīng)，且H2O2濃度會影響HRP的催化能力[24]。當體系中的H2O2濃度過低時，HRP活力釋放力較低，酶促反應(yīng)速率低。H2O2濃度對WBAX-BSA酶促共聚物Abs變化影響見圖3，H2O2濃度對WBAX-BSA酶促共聚物的ESI/EAI影響見圖4。

圖3 H2O2濃度對WBAX-BSA酶促共聚物Abs變化影響Fig.3 Effect of H2O2 concentration on the Abs change of WBAXBSA conjugates

圖4 H2O2濃度對WBAX-BSA酶促共聚物的ESI/EAI影響Fig.4 Effect of H2O2 concentration on the ESI/EAI of WBAX-BSA conjugates

當酶添加量0.2U/g，WBAX與BSA質(zhì)量比為10∶1時，測定反應(yīng)體系中不同 H2O2濃度（0、0.05、0.5、1、5、10 mol/L）對WBAX-BSA酶促共聚物Abs及乳化特性影響。由圖3可知，隨著體系中H2O2濃度增加，Abs325nm、Abs280nm呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，當體系中的H2O2濃度為0.5 mol/L時，Abs325nm下降29.0%，Abs280nm下降16.7%，Abs325nm、Abs280nm較低，隨后提高 H2O2濃度，Abs325nm、Abs280nm升高，說明與含有 0.5 mol/L H2O2的體系相比，過高的H2O2酶促體系中，阿魏酸與酪氨酸含量下降較少，WBAX與BSA交聯(lián)度減小。這是因為過高的H2O2濃度會使HRP喪失酶活力，從而交聯(lián)度降低[25]。

從圖4可以看出，隨著H2O2濃度增加，WBAXBSA酶促共聚物的EAI及ESI也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當WBAX與BSA體系中加入HRP及H2O2時，EAI及ESI分別由 160.8 m2/g及18.4 min提升至211.8 m2/g及32.9 min，EAI及ESI分別提升了31.7%及78.8%，隨著H2O2濃度增加，HRP酶活力逐漸喪失，WBAX與BSA交聯(lián)度減小，當其應(yīng)用在乳狀液體系中時，遷移到油水界面處的WBAX-BSA酶促共聚物數(shù)量減少，當反應(yīng)體系中的H2O2濃度達到10 mol/L時，EAI及ESI分別減小至160.0 m2/g及18.5 min，此時EAI及ESI與WBAX/BSA復(fù)合物體系EAI及ESI值相近，表明此時HRP酶活力在10 mol/L H2O2作用下接近完全失活，因此選定H2O2濃度0.5 mol/L作后續(xù)研究。

2.1.3 WBAX與BSA質(zhì)量比對性質(zhì)的影響結(jié)果

當H2O2濃度為0.5 mol/L，酶添加量0.2 U/g時，測定反應(yīng)體系中不同WBAX與BSA質(zhì)量比（1∶2、1∶1、2 ∶1、4 ∶1、10 ∶1、15 ∶1） 對 WBAX-BSA 酶促共聚物Abs及乳化特性影響。試驗結(jié)果見圖5及圖6。

圖5 WBAX與BSA質(zhì)量比對WBAX-BSA酶促共聚物Abs變化影響Fig.5 Effect of the mass ratio between WBAX and BSA on the Abs change of WBAX-BSA conjugates

圖6 WBAX與BSA質(zhì)量比對WBAX-BSA酶促共聚物的EAI/ESI影響Fig.6 Effect of the mass ratio between WBAX and BSA on the EAI/ESI of WBAX-BSA conjugates

由圖5可知，WBAX與BSA質(zhì)量比影響其交聯(lián)效果，所有WBAX-BSA酶促共聚物試驗組Abs325nm、Abs280nm均高于WBAX/BSA復(fù)合物對照組，且不同的質(zhì)量比組Abs325nm、Abs280nm下降幅度不一致，WBAX與BSA質(zhì)量比 1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、10∶1、15∶1 組 Abs325nm分別下降了20.5%、21.6%、22.3%、22.5%、28.9%、25.4%，而Abs280nm分別下降了1.3%、5.7%、7.4%、9.4%、17.2%、12.7%。試驗過程中，控制體系中的BSA含量一定，通過改變WBAX濃度配置不同質(zhì)量比的WBAX-BSA復(fù)合物，但是提取的WBAX中含有4.9%殘余蛋白質(zhì)，所以WBAX濃度高的樣品蛋白質(zhì)含量比WBAX濃度低的樣品稍有升高，隨著WBAX與BSA質(zhì)量比的增加，Abs325nm、Abs280nm下降幅度先增加后減小，說明WBAX與BSA的交聯(lián)度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，隨著WBAX含量的增加，體系中阿魏酸含量增加，因此與酪氨酸交聯(lián)的程度增加，但是隨著WBAX含量的持續(xù)增加，溶液黏度升高，反應(yīng)體系空間位阻增大，反應(yīng)速率反而降低[26]。

從圖6可以看出，隨著WBAX與BSA質(zhì)量比增加，WBAX-BSA的EAI呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，但是WBAX-BSA酶促共聚物試驗組的EAI都比WBAX-BSA復(fù)合物的EAI高，WBAX與BSA質(zhì)量比1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、10∶1、15∶1的 WBAX-BSA 酶促共聚物試驗組EAI分別上升了18.7%、20.2%、22.8%、23.3%、31.6%、19.6%，其中WBAX與BSA質(zhì)量比10∶1時，EAI值上升最明顯，這是因為當WBAX∶BSA質(zhì)量比為 10∶1時，WBAX與 BSA交聯(lián)度最高，WBAX-BSA酶促共聚物形成較多，當其應(yīng)用在乳狀液體系中時，遷移到油水界面的酶促共聚物也較多，其中酶促共聚物的WBAX部分提供了大量的親水羥基，BSA部分提供疏水性氨基酸。

不同質(zhì)量比下的酶促共聚物ESI呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，WBAX 與 BSA 質(zhì)量比 1∶2、1∶1、2∶1、4 ∶1、10∶1、15∶1的WBAX-BSA酶促共聚物試驗組ESI分別上升了 68.7%、69.6%、70.4%、71.1%、78.9%、78.8%。隨著WBAX與BSA質(zhì)量比的增加，酶促共聚物產(chǎn)量增多，遷移到油水界面處的目標產(chǎn)物增加，從而ESI增加，且體系中WBAX本身具有增稠力，可以增加乳狀液的穩(wěn)定性，所以WBAX與BSA質(zhì)量比15∶1試驗組ESI提升率與WBAX與BSA質(zhì)量比10∶1組相近，因此綜合這兩項指標，選定WBAX與BSA質(zhì)量比為10∶1作后續(xù)研究。

2.2 WBAX-BSA酶促共聚物形成表征

2.2.1 SDS-PAGE凝膠電泳分析

各樣品SDS-PAGE圖譜見圖7。

圖7 各樣品SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE of each sample

當多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)時，交聯(lián)產(chǎn)物會在SDSPAGE的濃縮膠中顯現(xiàn)染色條帶或者在濃縮膠和分離膠的交界處展現(xiàn)拖尾條帶[27]。由圖7可知，泳道1的WBAX雖然含有雜蛋白，但是可能蛋白分子量過小或者含量過低不能通過SDS-PAGE檢測到，當WBAX經(jīng)HRP交聯(lián)后（泳道2）也沒有蛋白條帶出現(xiàn)。據(jù)報道，天然BSA由3個染色條帶組成，主要條帶位于67 kDa處，在85 kDa～89 kDa和大于125 kDa處分別有兩個小的染色條帶[28]。BSA第五組分分子量約為68kDa（泳道3），在SDS-PAGE中呈現(xiàn)了3個條帶，與上述報道相似。經(jīng)過HRP作用后，在66.2 kDa左右的蛋白質(zhì)條帶上移且含量減少（泳道4），說明在HRP催化下，部分BSA能夠發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)。當HRP作用于WBAX與BSA體系時（泳道5），濃縮膠出現(xiàn)染色條帶，且進樣孔呈現(xiàn)藍色，而在WBAX/BSA復(fù)合物組（泳道6）中，濃縮膠中沒有出現(xiàn)染色條帶，且進樣孔沒有藍色出現(xiàn)，說明在HRP的作用下，部分BSA與WBAX發(fā)生交聯(lián)，形成分子量較大的酶促共聚物，被攔截在凝膠進樣孔外側(cè)未進入泳道。且根據(jù) WBAX（HRP）、BSA（HRP）、WBAX/BSA復(fù)合物組的進樣孔均無藍色出現(xiàn)，說明攔截在凝膠外側(cè)的大分子物質(zhì)是由HRP作用的WBAX-BSA酶促共聚物。

2.2.2 HPSEC分析

WBAX、WBAX-BSA酶促共聚物及 WBAX/BSA復(fù)合物的HPSEC示差（RI）的結(jié)果如圖8所示。

示差圖可以反應(yīng)各樣品分子量分布，WBAX/BSA復(fù)合物相對于WBAX曲線相向左偏移，雖然反應(yīng)體系pH值為6.5，此時混合體系中WBAX、BSA均帶負電，理論上不能發(fā)生靜電交聯(lián)，但是BSA為心形球狀結(jié)構(gòu)，帶負電的WBAX與其內(nèi)部結(jié)構(gòu)中裹帶的正電荷可發(fā)生靜電吸附作用，分子量變大造成分子量光譜向較大分子量方偏移。且WBAX-BSA酶促共聚物分子量光譜相比于WBAX/BSA復(fù)合物向左偏移，表明分子量比WBAX/BSA復(fù)合物分子量大，說明在HRP作用下，WBAX與BSA發(fā)生交聯(lián)生成WBAX-BSA酶促共聚物。

圖8 各樣品HPSEC圖譜Fig.8 HPSEC of each sample

3 結(jié)論

本研究中WBAX與BSA通過HRP作用，在酶添加量為 0.2 U/g、H2O2濃度 0.5 mol/L、WBAX 與 BSA 質(zhì)量比為10∶1時，Abs325nm、Abs280nm值最低，說明此時WBAX與BSA交聯(lián)度最高，且其作用的乳狀液EAI及ESI也較高，分別提升了31.6%、78.9%。并運用SDSPAGE及HPSEC技術(shù)分析表明WBAX在HRP作用下與BSA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)生成大分子的酶促共聚物，且WBAX與BSA的酶促共聚物能有效地改善其乳化特性。