梁應(yīng)鳳，郭姍姍，張 丹，盧敬釵，葉 奇，高 燕，李 倩△，Latimer N

1.解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心(北京 100088)；2.英國(guó)謝菲爾德大學(xué)健康與健康研究學(xué)院衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)和決策科學(xué)(謝菲爾德市 S1 4DA)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)作為最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，早期診斷特征不顯著，確診時(shí)多已處于局部晚期或晚期[1]。針對(duì)NSCLC的傳統(tǒng)治療模式(手術(shù)、放化療)目前處于瓶頸階段，患者5年生存率極低；而興起的分子靶向治療亦存在較大局限[2]。因此，尋找可行診療方法對(duì)于提高NSCLC患者療效至關(guān)重要。目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的重視，使其在惡性腫瘤的治療方面的功能重新受到重視[3]。健脾益腎方以黃芪、黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、旱蓮草、女貞子等配伍，具有健脾胃、補(bǔ)腎經(jīng)、補(bǔ)氣扶正及提升機(jī)體免疫功能等功效，可有助于輔助放化療等治療各類(lèi)疾病，包括腫瘤如乳腺癌[4-5]。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等生物學(xué)特征與腫瘤的惡性發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞體外增殖凋亡作用，以期為NSCLC找到中醫(yī)防治新策略。

資料與方法

1 試驗(yàn)試劑、儀器及藥物 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549(中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)。Trizol(賽默飛世爾，USA)、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，杭州主諾生物技術(shù)有限公司)、BCA試劑盒(碧云天)、熒光定量PCR儀(7500型，ABI公司，USA)、Western blot檢測(cè)抗體(Abcam，UK)、MTT溶液(天津?yàn)?yáng)生物制品有限公司)、二甲基亞砜(DMSO，北京華美生物工程公司)、酶標(biāo)儀(賽默飛，USA)、Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海銳賽生物技術(shù)有限公司)、流式細(xì)胞儀(FACS Calibur，BD公司，USA)。健脾益腎方各組分中藥均由本院制劑部提供。本方選取藥物均采用常規(guī)水煎法制成并嚴(yán)格按照提取過(guò)程進(jìn)行提取以備用。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549置于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于7 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，使用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔板中，每孔含2 ml DMEM完全培養(yǎng)基。細(xì)胞分為四組：空白對(duì)照組(僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液)、陰性對(duì)照組(加入細(xì)胞，不進(jìn)行中藥處理)、實(shí)驗(yàn)組(加細(xì)胞加中藥處理)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，制備成單細(xì)胞懸液，以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)9 d，每2 d檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%融合后，每孔加入20 μl 5 mg/μl的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，棄上清液，加入150 μl DMSO，室溫?fù)u床振蕩10 min，以DMSO調(diào)零。各組細(xì)胞分別在接種培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，在酶標(biāo)儀上于492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(光密度，OD)值，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，判斷健脾益腎方處理對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖的影響。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分組處理同前。轉(zhuǎn)染后次日，以0.25%胰酶消化細(xì)胞，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min下離心機(jī)離心5 min，棄上清液。調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，按照Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行細(xì)胞染色，置于4 ℃冰箱中染色15～30 min。收集各組NSCLC細(xì)胞，用Annexin-V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，4 ℃下2000 r/min離心10 min后棄去上清，預(yù)冷PBS洗滌并再次重懸細(xì)胞。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液混勻，室溫避光孵育10 min。隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，計(jì)算并獲取細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率以凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分率表示。

5 熒光定量PCR檢測(cè) 分組處理同前。轉(zhuǎn)染后次日利用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，并測(cè)定其濃度、純度及鑒定其完整性。取2 μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA。取10 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性45 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)。用ΔCt值法，以GADPH為內(nèi)參照定量Survivin、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)水平。

6 Western blot檢測(cè) 分別取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NSCLC細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入1 ml RIPA蛋白裂解液，12000 r/min，離心10 min。吸取上清液采用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取20 μg蛋白加樣至10%SDS-PAGE凝膠電泳后，后轉(zhuǎn)膜至PVDF，并5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。隨后，加入兔抗人Survivin、Bcl-2和Caspase-3、兔抗人GADPH，4℃孵育過(guò)夜。洗滌后加入山羊抗兔IgG-HRP二抗室溫孵育1 h。TBST洗膜后用ECL液顯色。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平(A目的蛋白/Aβ-actin)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(PSS，Inc，Chicago，IL，USA)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT增殖通過(guò)檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度值，繪制三組生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果，見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞在24、48、72 h的吸光度值明顯升高，組間差異顯著；而實(shí)驗(yàn)組24、48、72 h的吸光度值均顯著降低，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值逐漸增加，各時(shí)間段吸光度值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 見(jiàn)表2。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V-FITC/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與空白對(duì)照組相比，健脾益腎方處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。

表1 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖的抑制作用 [L/(g·cm)]

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

3 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表2。運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)不同處理情況下NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)2-△△CT法定量分析結(jié)果，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組Survivin和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，各指標(biāo)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，與空白對(duì)照組相比，健脾益腎方處理的實(shí)驗(yàn)組Survivin和Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)。

表2 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

4 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表3 健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05

利用Western blot法檢測(cè)不同處理情況下NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞Survivin、Bcl-2和Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組Survivin和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而健脾益腎方處理的實(shí)驗(yàn)組Survivin和Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

目前肺癌已成為我國(guó)腫瘤相關(guān)死亡率最高的惡性腫瘤之一[6]。細(xì)胞增殖凋亡是細(xì)胞生命活動(dòng)的關(guān)鍵特征之一。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究健脾益腎方對(duì)NSCLC細(xì)胞體外增殖凋亡作用，發(fā)現(xiàn)健脾益腎方可通過(guò)下調(diào)Survivin和Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制NSCLC的發(fā)展。具體而言，本體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同處理方式，將培養(yǎng)A549細(xì)胞系分為三組，分別為僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液的空白對(duì)照組，加入細(xì)胞，不進(jìn)行中藥處理的陰性對(duì)照組，以及加細(xì)胞加中藥處理的實(shí)驗(yàn)組(加細(xì)胞加中藥處理)。陰性對(duì)照組的設(shè)立為檢測(cè)NSCLC細(xì)胞中增殖凋亡和相關(guān)基因的表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組以健脾益腎方處理，目的在于探究該組方在改善A549細(xì)胞增殖凋亡的功能。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞在24 h、48 h、72 h的OD值明顯升高，細(xì)胞凋亡率下降，Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)。而健脾益腎方處理的實(shí)驗(yàn)組24 h、48 h、72 h的OD值均顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著上升，Survivin和Bcl-2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量下調(diào)，Caspase-3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，與空白對(duì)照組相比差異顯著。

健脾益腎方由黃芪、黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、枸杞子、旱蓮草、女貞子等組成，根據(jù)其組成可知，該藥在養(yǎng)氣補(bǔ)血、健脾補(bǔ)胃、滋肝補(bǔ)腎等方面效果佳，可用于緩解并改善患者放化療的毒副作用，從而達(dá)到扶正培本的功效[7]。肺癌屬中醫(yī)學(xué)“肺積”、“痞癖”、“息賁”等范疇[8]。既往中醫(yī)藥研究已顯示，中醫(yī)配伍在改善患者不良反應(yīng)、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)患者生存期等方面具有一定優(yōu)勢(shì)[9-11]。值得關(guān)注的是，在個(gè)體化辨證施治上，中醫(yī)藥配合治療更具特色，從而有助于顯著提高患者臨床療效。中醫(yī)學(xué)解釋肺癌發(fā)病機(jī)制提示，正氣虛損，而邪氣襲肺，肺臟功能失調(diào)，致脈絡(luò)瘀堵，集結(jié)于肺，日久成疾，且正氣虛損進(jìn)一步導(dǎo)致脾胃虛弱[12]。鑒于此，本健脾益腎方的黃芪可健脾和胃、補(bǔ)氣升陽(yáng)，適用于脾胃不和等癥；黨參可補(bǔ)氣健脾，改善脾胃虛弱之癥；白術(shù)補(bǔ)氣健脾，可用于治療肺脾氣虛之癥；枸杞子可養(yǎng)肝、滋腎、潤(rùn)肺；女貞子可補(bǔ)益肝等[13-14]。各方配伍，發(fā)揮補(bǔ)正氣、祛邪氣之功效，進(jìn)而起到抗腫瘤的功能。同時(shí)，Survivin、Bcl-2和Caspase-3作為凋亡相關(guān)蛋白，可調(diào)控并反映腫瘤細(xì)胞凋亡[15-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞中Survivin和Bcl-2均為上調(diào)表達(dá)，提示基因轉(zhuǎn)錄功能的增強(qiáng)，發(fā)揮抗凋亡作用；而Caspase-3下調(diào)表達(dá)，抗凋亡作用被抑制。而給予健脾益腎方處理的NSCLC細(xì)胞Survivin和Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Caspase-3表達(dá)上調(diào)，提示健脾益腎方可有助于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。作為細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控者，Bcl-2是主要的抗凋亡基因[18-19]；Survivin則是Bcl-2調(diào)控下的重要凋亡抑制因子，且其通過(guò)內(nèi)源性或外源性途徑參與凋亡抑制[20]。Bcl-2表達(dá)水平降低時(shí)，可誘導(dǎo)Survivin水平的降低，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。從中醫(yī)角度而言，健脾益腎方具有益氣散瘀功效，降低Survivin和Bcl-2表達(dá)，并促進(jìn)Caspase-3表達(dá)，最終發(fā)揮促NSCLC細(xì)胞凋亡的作用。

本研究提示健脾益腎方可通過(guò)下調(diào)Survivin和Caspase-3表達(dá)誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制NSCLC的發(fā)展，有助于加深我們對(duì)NSCLC發(fā)生和腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的了解，并為進(jìn)一步尋找臨床腫瘤早期治療提供參考。