駱 凡,陳 杰 ,袁 捷,韓祖成,劉冬玲 ,趙 媛 ,王 輝

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712046)；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)；3.西安市中醫(yī)醫(yī)院(西安 710021)

2019年12月底武漢出現(xiàn)多起不明原因發(fā)熱、咳嗽、氣促、呼吸困難、肺部感染，嚴(yán)重者可有急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭、死亡，其主要傳播途徑為呼吸道傳播，隨著疾病的蔓延，我國其他省市也相繼發(fā)現(xiàn)此類病例[1-2]。經(jīng)基因檢測(cè)為β-冠狀病毒屬(β-coronavirus)病毒，是一種新型冠狀病毒，世界衛(wèi)生組織(WHO)為其命名為新型冠狀病毒肺炎。此病潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)、人群普遍易感，目前治療上主要以抗病毒治療及對(duì)癥支持治療，尚無特效藥，對(duì)國民健康、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)帶來極大的不良影響。

中醫(yī)藥在SARS病毒肺炎、H1N1流感防治期間發(fā)揮了重要作用[3-4]。此次疫情發(fā)生以來國家衛(wèi)健委數(shù)次更新的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》(國家方案)都將中醫(yī)診療置于不可或缺的地位。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)為國家乙類傳染病范圍，屬中醫(yī)“疫病”、“瘟疫”范疇[5]。吳又可在《瘟疫論》中提及“疫者，感天地之戾氣”。其主要病位在肺，疫毒閉肺，則有發(fā)熱、咳嗽，或有黃痰、胸悶氣促、咳嗽憋喘、動(dòng)則氣喘，根據(jù)辨證論治及國家方案中醫(yī)診治方案予以麻杏石甘湯加減治療。麻杏石甘湯為張仲景《傷寒論》中治療肺熱咳喘的經(jīng)方，趙淑萍[6]在82例急性肺炎研究中，發(fā)現(xiàn)中藥麻杏石甘湯對(duì)于急性肺炎具有很好的治療效果。研究表明麻杏石甘湯臨床療效明顯，但其作用機(jī)制大多不詳。對(duì)于中藥的多成分、多通路協(xié)同作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能提供較好的研究方向。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、生物信息學(xué)等學(xué)科相結(jié)合,采用“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò),是對(duì)中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治、系統(tǒng)論的具體闡釋。因此針對(duì)麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的機(jī)理及機(jī)制,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法,對(duì)麻杏石甘湯的作用物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)理機(jī)制進(jìn)行挖掘,為麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

材料與方法

1 藥物活性成分篩選 查詢中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php，設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18)、中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm，設(shè)置Score cutoff 為20，P<0.05)；搜索關(guān)鍵詞“麻黃、杏仁、石膏、甘草” “MA HUANG、XING REN、SHI GAO、GAN CAO”，獲得其活性成分信息,并將相關(guān)資料導(dǎo)出Excel表格。

2 藥物作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將篩選出的麻黃、杏仁、石膏、甘草生物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)UniprotKB檢索功能對(duì)各靶點(diǎn)人類基因簡(jiǎn)稱進(jìn)行查詢，獲得麻杏石甘湯可能存在的靶點(diǎn)。

3 疾病靶點(diǎn)查詢 使用OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DrugBank(https://www.drugbank.ca)、GeneCards(http://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫，以“COVID-19、2019-nCoV、novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞在OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD、DrugBank、GeneCards數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，以新型冠狀病毒防治指南中推薦藥及當(dāng)前熱門研究抗新型冠狀病毒藥物“瑞德西韋(Remdesivir)、磷酸氯喹(Chloroquine)、拉匹拉韋(Lapilavir)、洛匹那韋(Lopinavir)、利托那韋(Ritonavir)”等在DrugBank數(shù)據(jù)庫中查詢，獲得新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疾病過程中已知的靶點(diǎn)。

4 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過文恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)將麻黃、杏仁、石膏、甘草等活性成分靶點(diǎn)與新型冠狀病毒肺炎靶點(diǎn)取交集，得到麻杏石甘湯與新型冠狀病毒肺炎相關(guān)的靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建麻杏石甘湯主要化學(xué)成分-對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

5 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將取交集后的靶點(diǎn)導(dǎo)入在線系統(tǒng)String 11.0(http://string-db.org)，獲得靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)。該系統(tǒng)對(duì)參與作用的靶點(diǎn)進(jìn)行打分，分值越高表明相互作用關(guān)系越密切。

6 生物通路分析 使用基因注釋工具DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行生物通路富集分析，分析麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎主要參與的生物通路，探討麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎可能的作用機(jī)制。

結(jié) 果

1 麻杏石甘湯活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn) 見表1。初步檢索得到已知的麻黃活性成分132種，如麻黃素、麻黃堿、去甲基麻黃堿、毛果堿、偽麻黃堿、乙酸薄荷酯、亞油酸、芹菜素等活性成分，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)1272個(gè)；杏仁活性成分27種，如苦杏仁苷、棕櫚酮、玉紅黃素、異松油烯、醋酸萜品酯、乙酸芳樟酯、芳樟醇、檸檬烯、花生酸、檸檬醛等，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)466個(gè)；石膏主要成分為硫酸鈣等；甘草主要活性成分125種，如甘草四酸、甘草次酸、異補(bǔ)骨脂酮、亞油酸甲酯、異蓮心堿、異熱馬酮、二甲基癸二酸酯、異三葉素、諾維定、甲基乙二醛等，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)690個(gè)。

2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 對(duì)279個(gè)生物活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，共獲得1417個(gè)靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.7.1對(duì)1417個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行整理，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。其中內(nèi)側(cè)紅色圖形表示麻黃、杏仁、石膏、甘草活性成分；外側(cè)藍(lán)色圖形中的表示該活性成分靶點(diǎn)。

表1 麻杏石甘湯中所含活性化合物基本信息

圖1 麻黃、杏仁、石膏、甘草-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 查詢OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD、GeneCards、DrugBank共得到新型冠狀病毒肺炎相關(guān)靶點(diǎn)49個(gè)。

4 中藥化合物-疾病共有靶點(diǎn) 通過韋恩圖取交集得到麻杏石甘湯與新型冠狀病毒肺炎的共同靶點(diǎn)24個(gè)。SUMO1、GSTA2、CRP、TNF、SMAD7、VCP、VCP、IL-13、CCL2、ADA、IL-6、ACE、PML、RNASE3、SOD1、CREB1、IL-4、ATF2、G6PD、NOS3、TP53、TLR9、IL-1B、ALB、NR1I2。以上靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范名稱后，靶點(diǎn)信息及Uniprot編碼等詳細(xì)信息見表2。

表2 基因蛋白詳細(xì)信息

5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI) 見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)圖

將上述作用蛋白導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫,限定物種為人,獲取蛋白之間相互作用關(guān)系,保存其TSV 格式文件,導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制相互作用網(wǎng)絡(luò),圖中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn),邊表示靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián),共涉及24個(gè)節(jié)點(diǎn),222個(gè)邊。使用Cytoscape 3.7.1 軟件進(jìn)行整理分析，可更清楚地反映麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，度>均值(9.25)關(guān)鍵靶點(diǎn)有11個(gè)，靶點(diǎn)IL-6、ALB在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中作用較大(度均為18)，其他前幾位分別為TP53(度為17)、TNF(度為16)、IL-1B(度為14)、CCL2(度為13)、CRP(度為13)、IL-4(度為12)、CREB1(度為11)、NOS3(度為11)、SOD1(度為10)等。

6 生物通路富集分析 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的GO富集分析結(jié)果如下(圖3～6)。

圖3 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的KEGG富集分析生物通路前10

本研究將麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的24個(gè)重要靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，獲得重要靶點(diǎn)參與的生物過程及通路通過KEGG富集分析共得到34條通絡(luò)，可以看出，麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與美洲錐蟲病通路、TNF信號(hào)通路、麻疹風(fēng)疹通路、瘧疾通路、乙型肝炎通路、炎癥性腸病通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、單純皰疹病毒感染、甲型流感通路、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、哮喘通路、肺結(jié)核通路、toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等重要通路。通過GO富集分析可以看出，在分子生物學(xué)功能中，主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、酶結(jié)合等；在細(xì)胞組分中，以細(xì)胞外為主；在生物學(xué)過程中，主要有調(diào)節(jié)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)分泌物分泌、炎癥應(yīng)答、免疫效應(yīng)的過程、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控過程等；進(jìn)一步說明麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎存在復(fù)雜的多靶點(diǎn)、多通路機(jī)制和過程。

討 論

麻杏石甘湯組成為麻黃、杏仁、石膏、甘草，治以辛涼宣泄，清肺平喘。方中麻黃性溫為君，以宣肺而泄邪熱；搭配辛甘大寒之石膏為臣，而且倍于麻黃，使宣肺而不助熱，清肺而不留邪；杏仁味苦為佐，降利肺氣，助麻黃、石膏清肺平喘；甘草調(diào)和寒溫，為佐使藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明方中麻黃所含麻黃素屬于苯丙胺類興奮劑，為擬腎上腺素藥，有收縮血管、舒緩平滑肌、加速新陳代謝的作用，在治療哮喘、感冒等疾病時(shí)廣泛應(yīng)用[7]。麻黃堿和偽麻黃堿二者互為立體異構(gòu)體。麻黃堿主要以復(fù)雜機(jī)制作用于各型腎上腺素受體，發(fā)揮對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)、器官、組織的作用[8-9]。偽麻黃堿的作用方式多以間接作用為主,臨床上主要作為抗感冒藥的成分。劉賾等[10]從細(xì)胞受體、離體器官以及整體動(dòng)物水平上探討麻黃堿與偽麻黃堿在平喘作用效果與機(jī)制方面的差異，結(jié)果表明草麻黃提取物含有麻黃堿及偽麻黃堿,麻黃堿在平喘效果上優(yōu)于偽麻黃堿,并且草麻黃中麻黃堿含量高于偽麻黃堿,草麻黃中主要由麻黃堿起到平喘作用,偽麻黃堿具有輔助的作用。杏仁主要成分苦杏仁苷具有抗炎[11-12]、抗腫瘤[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]、抗肺纖損傷[15]等多種藥理作用。苦杏仁苷類成分口服后，可在下消化道分解后產(chǎn)生少量氨基酸，可以抑制咳嗽中樞而起到止咳平喘的作用。其主要是通過抑制支氣管平滑肌細(xì)胞、抑制呼吸中樞與β2腎上腺素受體結(jié)合等機(jī)制[16]。甘草中主要成分甘草次酸是傳統(tǒng)中藥甘草中天然產(chǎn)物甘草酸的三萜苷元成分，具有多種藥理作用，包括抗炎[17]、抗病毒[18]、保肝[19]和抗腫瘤[20]等。研究表明以上成分可能參與麻杏石甘湯抗炎、改善呼吸道癥狀、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫力等作用，為其治療新型冠狀病毒肺炎提供依據(jù)。

麻杏石甘湯中各種活性成分間存在著密切的協(xié)同關(guān)系，其主要的靶點(diǎn)也在抗新型冠狀病毒肺炎中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為進(jìn)一步對(duì)麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎的作用機(jī)制進(jìn)行分析，將二者關(guān)系進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建(PPI)與生物通路富集分析。蛋白質(zhì)之間相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)圖是由數(shù)據(jù)分析每個(gè)蛋白質(zhì)彼此之間的相互作用，以明確各蛋白質(zhì)、靶點(diǎn)之間的相互聯(lián)系及相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。從篩選后的蛋白質(zhì)相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)中得到TP53、TNF、IL-1B、CCL2、CRP、IL-4、CREB1、NOS3、SOD1等重要靶點(diǎn)。通過GO富集分析可以看出，在分子生物學(xué)功能中，主要參與細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、酶結(jié)合等；在細(xì)胞組分中，以細(xì)胞外為主；在生物學(xué)過程中，主要有調(diào)節(jié)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)分泌物分泌、炎癥應(yīng)答、免疫效應(yīng)的過程、凋亡過程負(fù)調(diào)控、細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控過程等；通過KEGG富集分析共得到34條通路，美洲錐蟲病通路、TNF信號(hào)通路、麻疹風(fēng)疹通路、瘧疾通路、乙型肝炎通路、炎癥性腸病通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、單純皰疹病毒感染、甲型流感通路、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、哮喘通路、肺結(jié)核通路、toll樣受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等重要通路。新型冠狀病毒肺炎主要為新型冠狀病毒感染，而麻杏石甘湯亦可發(fā)揮抗病毒作用，根據(jù)目前已知通路，可能參與甲型流感通路、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)感染通路、麻疹風(fēng)疹通路、單純皰疹病毒感染、乙型肝炎通路等；新型冠狀病毒肺炎主要臨床表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)癥狀，而麻杏石甘湯可以通過哮喘通路、肺結(jié)核通路等發(fā)揮抗肺損傷作用；IL-6、TNF、TLR9可參與toll樣受體信號(hào)通路，富集分析顯示麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎主要參與抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗瘧、抗肺損傷等通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)與方法，對(duì)麻杏石甘湯的多成分、多靶點(diǎn)間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行了研究，挖掘出麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎主要參與抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗瘧、抗肺損傷等多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用的特點(diǎn)。目前疫情尚未結(jié)束，國家對(duì)中醫(yī)藥診治極其重視，中醫(yī)藥發(fā)揮明顯作用，本研究為麻杏石甘湯治療新型冠狀病毒肺炎提供機(jī)理參考，尚需要我們進(jìn)一步深入研究。