袁華偉 ，王 鑫，王 連，鄧婺遠，劉光錢，喻學淳，沈才洪，王松濤

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓 644000；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；4.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000）

雜醇油是含有3 個以上碳原子的一元醇類物質的總稱，在白酒中含量較大，也是最重要的三大芳香組分（脂肪族酸類、脂肪族酯類、高級醇類）之一[1]。濃香型白酒中雜醇油的主要成分為異戊醇、異丁醇、正丙醇和正丁醇等，尤其以異戊醇、異丁醇較為突出[2]。適宜的雜醇油含量及適當比例可使酒體豐滿圓潤，口感柔和協(xié)調(diào)；但雜醇油在人體內(nèi)氧化速度較乙醇慢，停留時間長，含量過高時，不僅會帶來異雜味，還會使消費者飲后引起頭痛、頭暈、神經(jīng)系統(tǒng)充血等癥狀，對人體有一定的毒害作用[3-4]。因此，國家標準規(guī)定白酒中雜醇油（以異戊醇、異丁醇計）的含量≤0.20 mg/100 mL。

雜醇油是白酒釀造過程中酵母發(fā)酵正常代謝的副產(chǎn)物，主要有兩種生成途徑。一種是酵母以氨基酸為基質的降解代謝途徑，一種是酵母以糖為基質的合成代謝途徑[5-7]。傳統(tǒng)釀酒生產(chǎn)過程中存在雜醇油含量普遍偏高的問題已經(jīng)引起了業(yè)界的廣泛關注。因此，為降低雜醇油含量，使其控制在合適的范圍內(nèi)，生產(chǎn)工藝上已采取了種種措施，如采用低溫發(fā)酵技術等，但其工藝復雜，生產(chǎn)成本高[8]。通過誘變選育及離子注入技術來選育氨基酸缺陷型的釀酒酵母，阻止其Ehrlieh 代謝途徑，從而獲得低產(chǎn)雜醇油的酒精酵母菌株[9-13]。但在釀造工業(yè)中存在回復突變等問題，生產(chǎn)上存在風險，只有選育低產(chǎn)雜醇油且高產(chǎn)乙醇的酵母菌進行發(fā)酵才能從根本上解決問題[14]。

濃香型白酒獨特的生產(chǎn)工藝造就了大曲和糟醅中特殊的微生物區(qū)系，富含具有工業(yè)價值的微生物資源。篩選大曲和糟醅中的功能微生物以及進行相關應用的研究正成為熱點[15-16]。本文首先通過TTC 培養(yǎng)基、乳酸培養(yǎng)基篩選低產(chǎn)雜醇油、高產(chǎn)乙醇的酵母菌株，對所選菌株進行鑒定，然后評價所選菌株的性能。使該菌株能夠應用于傳統(tǒng)白酒釀造生產(chǎn)，降低雜醇油含量，從而提高白酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料、試劑

大曲和糟醅樣品采集自瀘州濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)的釀酒車間，多點采樣后混合均勻。釀酒酵母購自市場上常用于白酒生產(chǎn)的酵母菌。

試劑及耗材：蛋白胨，酵母膏，瓊脂粉均為生化試劑，北京奧博星生物有限公司；異戊醇、異丁醇、正丙醇、乙酸乙酯等色譜分析用標準品均為色譜純，天津光復精細化工研究所；PCR 所用試劑購自上海生工生物工程公司；其他試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：YPD 液體培養(yǎng)基。121 ℃滅菌15 min，冷卻到50 ℃按1 U/mL加入青霉素。

平板分離培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，121 ℃滅菌15 min。

初篩培養(yǎng)基：TTC 培養(yǎng)基，TTC 0.1 g/L，乳酸5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6.0。乳酸培養(yǎng)基，乳酸40 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，氯化鈉0.1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，氯化鈣0.1 g/L，酵母膏0.2 g/L，瓊脂15 g/L，pH6.0。

復篩培養(yǎng)基：高粱汁培養(yǎng)基，高粱粉碎后按高粱∶水=1∶4的比例混勻后，90 ℃水浴下糊化90 min，冷卻到60 ℃，加入糖化酶，糖化2～3 h，煮沸5 min，雙層紗布過濾，加水調(diào)糖度為15 °Bx，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 儀器設備

SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州合飛凈化設備有限公司；SPX-250-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；T6 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；RX40 型密度折光儀，梅特勒-托利多上海有限公司；Power Pac Basic型電泳儀，美國Bio-Rad 公司；Gel Doc XR 型凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；7890A 型氣相色譜儀（配LZP-930 白酒分析專用柱，30 m×320μm×1 μm，Analytical Technology，蘭州化學物理研究所），美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化

將大曲、糟醅樣品置于富集培養(yǎng)基中，于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)48 h。用玻璃珠振蕩打散后，取合適梯度涂布于平板分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)。

待菌落長大后在平板上層注入TTC培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)2～3 h，挑選深紅色的菌株，轉接到乳酸培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑選菌落較大的作為初篩菌株。

1.2.2 低產(chǎn)雜醇油酵母菌的篩選

初篩菌株活化后接入YPD 培養(yǎng)基中增殖，使活菌濃度達到108個/mL，然后取5 mL 接入裝有500 mL 高粱汁的錐形瓶中，28 ℃培養(yǎng)72 h 后測定發(fā)酵液的乙醇、異戊醇、異丁醇含量。選擇產(chǎn)雜醇油低、產(chǎn)酒能力強的酵母菌株為目標菌株。

1.2.3 酵母菌株鑒定

菌落及菌體形態(tài)觀察：篩選出的酵母菌株，劃線于分離培養(yǎng)基瓊脂平板上，于28 ℃下厭氧培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落形態(tài)；用光學顯微鏡觀察個體形態(tài)。

菌種16Sr DNA 鑒定：離心收集液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期的酵母菌體，采用Bacterial DNA Kit 試劑盒提取總DNA。提取得到的總DNA 采用0.6 %瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。采用酵母通用引物NLl（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTTT CAAGACGG-3'）對總DNA 進行PCR 擴增，送至上海生工公司進行測序。將測序得到的26S rDNA D1/D2序列在eztaxon上進行BLAST 比對，比較分離菌株與已知酵母菌相應序列的相似程度，與Gen Bank 數(shù)據(jù)庫做相似性分析。

1.2.4 酵母菌的性能檢測

以波長600 nm 處測定酵母菌發(fā)酵液的OD 值來研究酵母菌的生長性能[17]。

耐溫性實驗：將酵母菌接種到YPD 液體培養(yǎng)基中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的最適生長溫度。

耐酸性實驗：將酵母菌接種在起始pH 值分別為3.0、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5的YPD液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的最適生長pH值。

耐糖性實驗：將酵母菌接種在蔗糖、葡萄糖濃度分別為10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、35 %的YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的耐糖性。

耐酒精實驗：將酵母菌接種到乙醇含量分別為8 %vol、10 %vol、12 %vol、14 %vol、16 %vol、18 %vol、20 %vol 的YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度下培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液的OD值，研究酵母菌的耐酒精程度。

生長曲線：把酵母菌接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，于最適溫度和pH 值下培養(yǎng)，每隔2 h 在波長600 nm處測一次發(fā)酵液的OD值。

1.2.5 高粱汁發(fā)酵

將所篩選的酵母菌用于高粱汁發(fā)酵，以釀酒酵母菌為對照組，發(fā)酵7 d，檢測雜醇油、乙醇及其他香氣成分的含量。

1.2.6 乙醇、雜醇油及其他香氣成分分析

取發(fā)酵液樣品，經(jīng)減壓蒸餾后取餾出液，過0.2 μm 微孔濾膜，分析乙醇、雜醇油及其他香氣成分的含量。

乙醇含量的測定：采用密度折光儀分析。

雜醇油及其他香氣成分的測定：用氣相色譜分析，汽化溫度：220 ℃；檢測器溫度：230 ℃；柱溫：35 ℃；升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持6 min 后，以4 ℃/min 升溫至170 ℃，保持3 min，以40 ℃/min升至220 ℃，保持2 min；進樣量：0.4μL。

2 結果與分析

2.1 酵母菌的分離純化和篩選

通過平板分離培養(yǎng)基分離純化，從大曲中篩選了57 株酵母菌；第二步用TTC 培養(yǎng)基和乳酸培養(yǎng)基進行初篩，篩選了18 株酵母菌。利用TTC 培養(yǎng)基是為了篩選高產(chǎn)乙醇的酵母菌，因為只有選育高產(chǎn)乙醇及低產(chǎn)雜醇油的酵母菌才有實際意義。由于雜醇油的生成與乳酸的代謝途徑正好相反，因此通過乳酸培養(yǎng)基從大曲中篩選低產(chǎn)雜醇油的酵母菌[10]。

對初篩的18 株酵母菌進行高粱汁發(fā)酵，發(fā)酵液的乙醇含量、異戊醇、異丁醇等雜醇油含量如表1所示。從表1可知，所篩選的酵母菌中LJ-07、LJ-15、LJ-18 產(chǎn)酒能力較好，但產(chǎn)雜醇油含量較高；LJ-07、LJ-10、LJ-16、LJ-17 酵母菌產(chǎn)雜醇油含量低，但是產(chǎn)酒能力較差；相對而言，LJ-07 酵母菌產(chǎn)雜醇油較低且產(chǎn)酒能力較好。后續(xù)使用LJ-07 酵母菌進行試驗。

表1 發(fā)酵液雜醇油、乙醇含量 (mg/L)

2.2 酵母菌株鑒定

2.2.1 菌落及細胞形態(tài)觀察

酵母菌株LJ-07 經(jīng)進一步純化后，進行菌落特征和個體形態(tài)觀察。在YPD 瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征和顯微鏡下觀察的個體形態(tài)如圖1 所示。圖1中（A）是在平板上生長的LJ-07 酵母菌，菌落易用針挑起，大而厚，質地均勻，表面濕潤光滑、不透明、黏稠，顏色單調(diào)，呈乳白色，正反面及中央與邊緣顏色一致，有不規(guī)則的毛狀物。圖1 中（B）是在400倍顯微鏡下觀察到的LJ-07 酵母菌，球形、卵圓形、橢圓形，無鞭毛。

2.2.2 酵母菌株26Sr DNA基因序列測定結果

酵母菌株LJ-07 的26Sr DNA 核苷酸測序結果在NCBI 使用BLASTN 比對初步確定為釀酒酵母，從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得有關種的公認標準序列數(shù)據(jù)，使用ClustalX 1.8 對齊后使用MEGA 2.1 計算序列相似性并作系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖2。系統(tǒng)發(fā)育樹中篩選出的酵母菌株與Saccharomyces cerevisiae屬同一分枝，確定篩選出的酵母菌株為Saccharomyces cerevisiae，暫命名為酵母菌LJ-07。

2.3 酵母菌的性能測定（圖3）

酵母菌株LJ-07 在不同條件下的生長情況如圖3 所示，乙醇濃度、pH 值對酵母菌生長的影響較大，溫度、糖濃度對酵母菌生長的影響相對較小。以下對圖3中4種影響因素結果進行分析。

2.3.1 溫度對酵母菌生長的影響

溫度對酵母菌的生長非常重要，溫度過高過低都會抑制酵母菌的生長，甚至會使其失活，同時，酵母菌的最適生長溫度范圍對酒類發(fā)酵至關重要。溫度對酵母菌生長的影響如圖3(A)所示，溫度在30 ℃以下時隨著溫度的升高，酵母菌的生長隨溫度的上升呈上升趨勢；溫度在30 ℃之上時，酵母菌的生長隨溫度的上升呈下降趨勢；溫度在25～35 ℃時，酵母菌生長較好，因此，其最適生長溫度為25～35 ℃。

2.3.2 pH值對酵母菌生長的影響

pH 值過高或過低都會影響酵母菌的生長和代謝產(chǎn)物的生成，甚至會使酵母菌失活。如圖3(B)所示，pH6～7 時，酵母菌生長良好，pH6.5 時，酵母菌的OD值最大，為酵母菌的最適pH值。

2.3.3 糖濃度對酵母菌生長的影響

葡萄糖和蔗糖濃度對酵母菌生長的影響如圖3(C)所示，酵母菌在葡萄糖濃度10%時，菌體濃度最大，生長繁殖最為迅速；酵母菌在蔗糖含量為10%和25%時菌體濃度都較大。葡萄糖和蔗糖的濃度達到35%時，酵母菌都能夠生長，表明酵母菌具有一定的耐糖能力。

2.3.4 乙醇濃度對酵母菌生長的影響

乙醇濃度對酵母菌生長的影響如圖3(D)所示，乙醇濃度越高，酵母菌的生長越弱，當乙醇含量為8%vol～14%vol 時，酵母菌生長情況較穩(wěn)定；乙醇含量為16 %vol～18 %vol 時，酵母菌生長緩慢；乙醇含量為20%vol 時，酵母菌基本不生長。過高的乙醇含量對酵母菌種具有毒害作用，乙醇發(fā)酵時要求所用的酵母菌具有一定的耐乙醇的能力，酒類發(fā)酵生產(chǎn)中乙醇含量大多數(shù)在14%vol 以下，所篩選的酵母菌能滿足生長的需要。

2.3.5 酵母菌的生長曲線（圖4）

所篩選的酵母菌在最適生長溫度和最適生長pH 值下進行生長曲線測定，其結果如圖4 所示，在0～4 h 為生長延滯期，6～18 h 為對數(shù)生長期，18 h以后處于生長相對穩(wěn)定期，20 h 后菌體濃度略有降低。

2.4 高粱汁發(fā)酵

用篩選的LJ-07 酵母菌進行高粱汁發(fā)酵，以釀酒酵母為對照組，發(fā)酵液雜醇油、乙醇及其他香氣成分的含量如表2 所示。LJ-07 號酵母菌產(chǎn)雜醇油的量為233.61 mg/L，比釀酒酵母降低了23.53 %；而對乙醇生成能力影響不大，對其他香氣成分的生成量也幾乎沒有影響。

3 結論

從瀘州老窖濃香型白酒釀造大曲和糟醅中篩選出1 株低產(chǎn)雜醇油、高產(chǎn)乙醇的酵母菌LJ-07。對該株酵母菌進行26S rDNA 基因序列分析，確定其為Saccharomyces cerevisiae，該菌株對溫度、酸度、糖度及乙醇的耐受性能好，最適溫度的范圍為25～30 ℃，最適pH值為6.5，且耐糖、耐乙醇性能較好。與常用的釀酒酵母相比，酵母菌LJ-07 的雜醇油產(chǎn)量降低了23.53%，而產(chǎn)乙醇的能力持平，該菌可應用于濃香型白酒等傳統(tǒng)釀酒工業(yè)，以降低白酒的雜醇油含量。

表2 發(fā)酵高粱汁乙醇、雜醇油等香氣成分含量(mg/L)