許強華 陳新軍 劉平非 謝 騰 陳曉巍 陳治軍

傳統(tǒng)的手術治療聯(lián)合術后放療、化療對惡性膠質(zhì)瘤的治療效果有限[1]。近年來，尋求惡性膠質(zhì)瘤新的治療方法越來越被重視。由于傳統(tǒng)的腫瘤放療、化療與病毒生物療法并無交叉耐藥性，因此，可以聯(lián)合傳統(tǒng)放療、化療與病毒治療，以達到協(xié)同或疊加效應[2]。 本文探討組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑 制 劑 曲 古 抑 菌 素 A（tropicostatin A，TSA）聯(lián)合野生型Ⅰ型單純皰疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1）對體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞（C6 細胞）增殖、凋亡的影響，為HDAC抑制劑聯(lián)合溶瘤病毒生物治療惡性膠質(zhì)瘤提供參考。

1 材料與方法

1.1 C6 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復蘇C6 鼠膠質(zhì)瘤細胞株（中科院細胞庫），DMEM+10%FBS+1%雙抗（美國Gibco公司），T25細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。細胞長滿培養(yǎng)瓶表面80%～90%，0.25%胰酶（吉林省吉諾生物工程有限責任公司）消化2 min，加新鮮完全培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹散細胞，收集至15 ml離心管中，1 000轉(zhuǎn)/min 離心5 min，去上清，加入新鮮完全培養(yǎng)基吹散細胞團，細胞計數(shù)，細胞懸液按3×104/cm2移至新的培養(yǎng)瓶中傳代。

1.2 HSV-1病毒擴增及滴度測定 接種HSV-1（武漢大學病毒研究所饋贈）懸液0.5 ml 于已鋪有細胞的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，待80%的細胞出現(xiàn)病變后，反復凍融三次，通過CsCl 密度梯度離心法進行抽提、純化HSV-1。最后通過空斑形成實驗準確測定其滴度。

1.3 CCK-8 法檢測C6 細胞增殖活性 細胞消化后計數(shù)并調(diào)整細胞密度為5×104個/ml。96孔板上每孔加入100 μl 細胞懸液，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日置換新鮮培養(yǎng)基。每孔培養(yǎng)體積200 μl，設對照組（加入等體積培養(yǎng)基）、TSA 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 處理）、HSV-1（加入10 MOI HSV-1 處理）及TSA+HSV-1 組（加入0.5×10-3μmol/L TSA 和10 MOI HSV-1 處理）共4 組，每組設5 個復孔。另設空白調(diào)零孔。培養(yǎng)48、72 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液（東仁化學科技有限公司），培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。室溫平衡后，用酶標儀測定450 nm處吸光度。計算各組細胞增殖活性。

1.4 C6 細胞凋亡率的檢測 同CCK-8 法制備細胞懸液及分組。培養(yǎng)48、72 h 后，棄去培養(yǎng)基，漂洗后胰酶消化，加完全培養(yǎng)基離心，棄上清。將細胞重懸于400 μl 結(jié)合緩沖液中，每管加入5 μl Annexin VFITC 和5 μl PI（美國BD 公司），室溫避光孵育15 min，混勻，70 μm 篩網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移至流式管，1 h 內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.5 RT-PCR 檢測血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA 表達水平 取細胞樣品，加入1 ml RNAiso Plus（Trizol），吹打細胞，加入200 μl氯仿，混均、離心，吸取上清至另一離心管中，加入等量的異丙醇混勻，-20 ℃沉淀，4 ℃離心，棄上清。加入1 ml 75%乙醇，4 ℃離心，棄上清，真空干燥5～10 min。20 μl DEPC H2O 溶解RNA 樣品，RNA純度的測定和RNA 的定量以DEPC H2O 為對照，取2 μl RNA溶液于酶標儀上檢測樣本濃度和質(zhì)量。將RNA 樣品進行逆轉(zhuǎn)錄反應及PCR 擴增反應。引物序列：VEGF 正義鏈5'-TCACCGGAAAGACCGATTAAC-3'，反義鏈5'-CCCTTCATGTCAGGCTTTCT-3'；內(nèi)參GAPDH 正義鏈5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'，反義鏈5'-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'。1.6 免疫印跡法檢測VEGF蛋白水平 將細胞樣品用胰酶消化、離心、洗滌后轉(zhuǎn)移至EP管中，加入200 μl的RIPA冰上裂解30 min，4 ℃離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至離心管，用BCA 法檢測細胞裂解液的蛋白濃度。通過制膠，樣品處理后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，顯影拍照分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行分析；計量資料以±s 表示，采用方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TSA 聯(lián)合HSV-1 對C6 細胞增殖活性的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細胞增殖活性較對照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞增殖活性較TSA 組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 TSA 聯(lián)合HSV-1 對C6 細胞凋亡率的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6 細胞凋亡率較對照組顯著增高（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞凋亡率較TSA 組和HSV-1 組明顯增高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 TSA聯(lián)合HSV-1對C6細胞VEGF表達水平的影響 處理48、72 h，TSA 組、HSV-1 組、TSA+HSV-1 組C6細胞VEGF mRNA和蛋白表達水平較對照組顯著降低（P＜0.05），而且，TSA+HSV-1 組C6 細胞VEGF mRNA和蛋白表達水平較TSA組和HSV-1組明顯降低（P＜0.05）。見圖3、4。

3 討論

溶瘤病毒的溶瘤特性對治療惡性膠質(zhì)瘤具有極大潛力，并在很多基礎研究及臨床試驗中得到了證實[3]。HSV-1為研究最早的溶瘤病毒，為了提高溶瘤病毒治療的安全性、靶向性及溶瘤效應，目前已研發(fā)出多種基因重組HSV-1[4]。

組蛋白乙?；{(diào)控基因表達是重要的表觀遺傳學修飾機制之一。研究表明，由于乙酰化的組蛋白分子電荷的改變，使染色體結(jié)構松散而增加轉(zhuǎn)錄因子和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子結(jié)合到基因啟動子的機會，激活腫瘤抑制基因的表達，促進腫瘤細胞凋亡[5，6]；同時也通過導致腫瘤細胞周期停滯、阻止癌基因表達抑制腫瘤細胞增殖[7～9]。

一直以來，傳統(tǒng)的放療與化療的聯(lián)合作用較易出現(xiàn)交叉耐藥，導致治療效果不理想。由于目前還沒有關于腫瘤細胞對化療和溶瘤病毒交叉耐藥的報道，更重要的是，大多數(shù)情況下，對化療抵抗的腫瘤細胞表現(xiàn)出對溶瘤病毒治療的敏感[3]。本研究應用體外C6細胞模型，結(jié)果顯示，TSA+HSV-1聯(lián)合作用較各單一作用效果更好。這說明TSA 聯(lián)合HSV-1對體外培養(yǎng)的C6 細胞可產(chǎn)生協(xié)同或疊加殺傷作用。另外，TSA+HSV-1 聯(lián)合作用明顯降低C6 細胞VEGF 表達式平，這提示TSA+HSV-1 聯(lián)合作用抗腫瘤效應可能與降低VEGF表達有關。