羅 敏，徐 廣，譚秋生，章文偉，任星宇，鄧才富

(重慶市藥物種植研究所 中藥材質(zhì)量控制研究中心，重慶 408435)

藥用植物栽培中普遍存在一個突出問題：隨著藥用植物年齡增加或重茬、連作，植株生長不良，中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度下降，如當(dāng)歸[1]、地黃[2]、三七[3]等。由于中藥材需求不斷增加，實行連作或復(fù)種連作的面積越來越大，加之占我國栽培品70%左右的根莖類中藥材中絕大部分均忌連作，因此，連作障礙已成為制約我國中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題。藥用植物連作障礙與其產(chǎn)生的化感物質(zhì)密切相關(guān)，植物化感自毒作用是發(fā)生連作障礙的重要因素之一，相關(guān)報道已證明蒼術(shù)[4]、當(dāng)歸[5]等中藥材的連作障礙與自毒作用有關(guān)。

本課題組前期在對半夏的栽培研究中發(fā)現(xiàn)，半夏連作后更容易患塊莖腐爛病，甚至有生育期縮短現(xiàn)象，嚴(yán)重影響藥農(nóng)和企業(yè)的種植積極性。連作障礙一直是制約半夏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要原因，為半夏人工栽培發(fā)展的技術(shù)難題，因一直未能摸清其形成機(jī)理，故無法對癥下藥找準(zhǔn)良方。本研究通過對半夏及根際土壤化感效應(yīng)的初步研究，探索半夏不同浸提液對不同種子萌發(fā)化感效應(yīng)的差異性，以期為半夏化感作用研究提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步尋求植物間合理組合的生物防控技術(shù)來緩解連作障礙問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏塊莖、地上部及土壤均采自連作2年的半夏試驗地，土壤為半夏根際土壤。受體半夏種子于2018年6月采自試驗地；白菜種子為四季小白菜(京研益農(nóng)種業(yè)科技有限公司)；狗尾草種子于2018年9月采自試驗地周圍。

1.2 浸提液制備

半夏塊莖、地上部浸提液：將清洗晾干并去表皮的半夏塊莖、清洗晾干的半夏地上部，分別稱取200 g，充分研磨后分別加入1 000 mL蒸餾水，浸泡并振蕩提取24 h，過濾，濾液離心，上清液定容至1 000 mL，得相當(dāng)于200 mg/mL的半夏塊莖、地上部浸提母液；分別稀釋成25、50、100 mg/mL 3個質(zhì)量濃度梯度，以0 mg/mL為對照(CK)，各處理按照濃度從小到大依次編號，塊莖為CK、T25、T50、T100；地上部為CK、P25、P50、P100。

土壤浸提液：取200 g新鮮根際土壤，按照1∶2(w/v)的比例加入400 mL蒸餾水，充分振蕩后靜置過夜，離心取上清液，得相當(dāng)于500 mg/mL的根際土浸提母液；稀釋成50、100、250 mg/mL 3個質(zhì)量濃度梯度，以0 mg/mL為對照(CK)，各處理按照濃度從小到大依次編號為CK、S50、S100、S250。

1.3 試驗設(shè)計

挑選籽粒飽滿、大小均勻一致的種子(半夏、白菜、狗尾草)，用10%雙氧水消毒1 min，用蒸餾水沖洗2～3次；將20粒種子均勻播種在墊有2層濾紙、直徑為9 mm的培養(yǎng)皿中，加入適量不同質(zhì)量濃度的浸提液，以液體不淹過種子為準(zhǔn)；每處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿置于20℃、相對濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每天補(bǔ)加適量對應(yīng)的浸提液，以保證種子萌發(fā)及正常生長需要。

以胚根長度≥1 mm為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)芽第6天計算發(fā)芽勢，第10天統(tǒng)計發(fā)芽率。發(fā)芽勢=當(dāng)天發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽率=全部正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。化感效應(yīng)分析參照Willamson和Richardson的化感效應(yīng)指數(shù)(RI)進(jìn)行，RI=T/C-1，式中T為測定值，C為對照值。當(dāng)RI>0時，為促進(jìn)作用；RI<0時，為抑制作用；RI絕對值的大小與作用強(qiáng)度一致[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏塊莖浸提液的自毒化感效應(yīng)

由圖1和表1可知，半夏塊莖浸提液對半夏、白菜及狗尾草的種子萌發(fā)具有明顯影響。在本試驗中，當(dāng)濃度為T100時，半夏的自毒抑制作用最強(qiáng)，其種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于對照，分別比對照降低18.41%和29.84%，其化感指數(shù)分別為-0.10和-0.27。另外，在較低濃度T25時，其發(fā)芽率化感指數(shù)RI為0.00，說明半夏塊莖浸提液低質(zhì)量濃度對其自身種子的萌發(fā)沒有影響或抑制作用不明顯。

半夏塊莖浸提液對白菜及狗尾草種子萌發(fā)的影響因濃度不同而存在差異。在T25時，二者的發(fā)芽率相對較高；且此時白菜、狗尾草種子發(fā)芽率的化感指數(shù)分別為0.005、0.02(>0)，說明低質(zhì)量濃度對二者種子的發(fā)芽率具有一定的促進(jìn)作用；而隨著濃度的升高，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢均明顯降低。

圖1 不同濃度半夏塊莖浸提液對3種植物種子萌發(fā)的影響

表1 不同濃度半夏塊莖浸提液對3種植物種子萌發(fā)的化感指數(shù)

2.2 半夏地上部分浸提液的自毒化感效應(yīng)

本試驗半夏地上部分不包括珠芽和佛焰苞。由圖2和表2可知，地上部浸提液在低質(zhì)量濃度P25時對自身種子發(fā)芽率沒有影響，在高質(zhì)量濃度時則表現(xiàn)為抑制作用，且該抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。對半夏種子發(fā)芽勢的影響則表現(xiàn)為抑制作用，具有濃度效應(yīng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 mg/mL以上時抑制作用更顯著。

半夏地上部浸提液對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，且該抑制作用具有濃度效應(yīng)。不同濃度處理的白菜、狗尾草種子的發(fā)芽率均明顯低于對照，在P100時，分別比對照降低了11.45%、9.25%。對發(fā)芽勢的影響更顯著，隨著浸提液濃度的增加，二者發(fā)芽勢呈顯著下降趨勢；在最大質(zhì)量濃度P100時，分別比對照降低了38.30%、18.45%。白菜種子發(fā)芽勢對濃度變化更為敏感，在50 mg/mL時下降顯著。

圖2 不同濃度半夏地上部浸提液對3種植物種子萌發(fā)的影響

表2 半夏地上部不同濃度浸提液對3種植物種子萌發(fā)的化感指數(shù)

2.3 連作半夏根際土壤浸提液的自毒化感效應(yīng)

半夏根際土壤浸提液對自身種子萌發(fā)的自毒效應(yīng)見圖3和表3。在本試驗中低質(zhì)量濃度S50時，半夏種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢均與對照無顯著差異，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)100 mg/mL后差異顯著，且S250時二者的化感指數(shù)分別為-0.25和-0.33。整體而言，半夏根際土壤浸提液對自身種子的萌發(fā)具有抑制作用，且該影響作用隨化感物質(zhì)溶液濃度的升高而增強(qiáng)。

半夏根際土壤不同濃度浸提液對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有不同程度的影響。圖3和表3表明，不同濃度處理的白菜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著低于對照，且隨著濃度的升高均呈明顯的下降趨勢，最大濃度時分別降低14.43%和46.42%。低濃度對狗尾草種子的萌發(fā)沒有影響或影響較小(RI=0.00)，但隨濃度升高，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均不同程度地下降，S250時化感指數(shù)分別為-0.25和-0.15。以上均說明，半夏根際土壤化感物質(zhì)對白菜及狗尾草種子的萌發(fā)具有抑制作用。

圖3 不同濃度半夏根際土壤浸提液對3種植物種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響

表3 半夏根際土壤不同濃度浸提液對3種植物種子萌發(fā)的化感指數(shù)

3 結(jié)論與討論

前人通過對多種中藥材的研究，普遍認(rèn)為化感作用是生態(tài)系統(tǒng)中植物間自發(fā)進(jìn)行的化學(xué)調(diào)控，自毒現(xiàn)象是化感作用的重要形式之一[7-9]。在自然界中，化感物質(zhì)通過地上部雨水、霧滴淋溶、根系分泌物、植物殘茬分解機(jī)氣體揮發(fā)等途徑釋放的次生代謝產(chǎn)物在土壤中過度積累，從而對同一塊土地種植同種或同科植物生長產(chǎn)生危害。

本試驗通過模擬雨水淋溶途徑研究發(fā)現(xiàn)，半夏塊莖、地上部分及根際土壤中化感物質(zhì)對受試種子的萌發(fā)具有化感作用，且不同部位、不同濃度的化感強(qiáng)度不同，不同作物的化感反應(yīng)亦有差異。低濃度(25 mg/mL)地上部浸提液對半夏種子發(fā)芽率沒有影響，但對發(fā)芽勢具有自毒抑制作用；而低濃度塊莖與根際土壤浸提液對半夏種子萌發(fā)均具有一定抑制作用，且該自毒抑制作用隨濃度的升高而增強(qiáng)。低濃度(25 mg/mL)塊莖浸提液對白菜種子萌發(fā)具有一定促進(jìn)作用，但與對照的差異不顯著。地上部及根際土壤浸提液對白菜種子萌發(fā)具有抑制作用，其中發(fā)芽勢對濃度變化更為敏感，在50 mg/mL時下降顯著。低濃度塊莖浸提液對狗尾草種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，而低濃度根際土壤浸提液對狗尾草種子的萌發(fā)沒有影響或影響較小，地上部浸提液具有明顯抑制作用。三種浸提液對受試種子萌發(fā)的抑制作用具有濃度效應(yīng)，均隨試驗設(shè)置濃度的提高而逐漸增強(qiáng)。

相關(guān)研究表明，化感物質(zhì)在半夏不同組織中的含量存在差異，且不同部位浸提液對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長具有化感作用，葉浸提液存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制現(xiàn)象[10]。半夏塊莖浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長具有化感抑制作用[11]，而其根際土壤浸提液對白菜種子發(fā)芽率和胚根生長有化感促進(jìn)作用[12]。塊莖浸提液對巴天酸模、反齒莧和灰綠藜3種雜草發(fā)芽率的影響達(dá)顯著水平，且在浸提液中的化感物質(zhì)達(dá)到一定量時，化感物質(zhì)之間存在協(xié)同作用，而超過一定量則彼此之間存在拮抗作用[13]。在本研究中不同濃度對雜草狗尾草種子萌發(fā)的影響未達(dá)顯著水平，一方面說明或許狗尾草對半夏體內(nèi)的化感物質(zhì)具有一定的耐受性；另一方面或許是濃度設(shè)置不夠，此類猜想有待進(jìn)一步研究。

以上研究結(jié)果說明半夏及其連作土壤中存在抑制種子萌發(fā)的化感物質(zhì)，隨著種植年限的延長，大量的半夏根系分泌物及殘體腐解都會向土壤中釋放大量的化感物質(zhì)，從而抑制作物的生長，最終導(dǎo)致減產(chǎn)。因此，或許有望通過縮短半夏輪作間隔年限、與作物合理組合的生物防控技術(shù)改善生長環(huán)境相結(jié)合的方式來克服該連作障礙難題，此亦為下一步研究計劃。