李 超，楊偉偉

(1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥理教研室，河北 滄州 061001；2.滄州市中心醫(yī)院 婦二科，河北 滄州 061001)

碘是合成甲狀腺激素必不可缺少的微量元素[1]，機(jī)體內(nèi)缺碘會(huì)導(dǎo)致多種甲狀腺疾病，并引起心腦功能障礙、代謝功能障礙等[2,3]。黃芪作為傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，具有抗氧化、延緩衰老和促進(jìn)機(jī)體代謝等多方面的藥理作用[4]，通過微生物發(fā)酵制備的黃芪發(fā)酵物可以使黃芪的有效成分更加充分利用[5]。本研究旨在觀察黃芪及其發(fā)酵物對(duì)碘缺乏大鼠所致海馬和肝臟組織氧化損傷的保護(hù)作用，為該病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4月齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(110±10)g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。12 h晝夜循環(huán)，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度(50±5)%。

1.2 儀器和試藥

Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司生產(chǎn))，Spectra MaxM4全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)分子公司生產(chǎn))，Sigma 3K15型超速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司生產(chǎn))，SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn))，Milli-Q Academic超純水器(美國(guó)Millipore公司生產(chǎn))。

黃芪購(gòu)自河北祁澳中藥有限公司；過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

碘缺乏飼料購(gòu)自北京小黍有泰生物科技有限公司，小麥、玉米、黃豆按30∶30∶40的比例加入適量的添加劑制成低碘飼料，其碘含量為20 μg·kg-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品的制備

制備黃芪提取液[6,7]和黃芪發(fā)酵提取液[8,9]，將這兩種劑型各稀釋成高、中、低劑量(4.00、2.00、1.00 g生藥·kg-1)備用。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模給藥

取4周齡SPF級(jí)Wistar大鼠80只，體重(110±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體重均衡原則隨機(jī)分為8組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、黃芪提取液及黃芪發(fā)酵提取液高劑量(4.00 g生藥·kg-1)、中劑量(2.00 g生藥·kg-1)、低劑量(1.00 g生藥·kg-1)組，每組雌雄各半。正常對(duì)照組大鼠全程飼以普通飼料(飼料平均碘含量300 μg·kg-1)，每日ig等體積雙蒸水。其余各組大鼠飼以低碘飼料(飼料平均碘含量20 μg·kg-1)，每日ig等體積雙蒸水。3個(gè)月后復(fù)制出碘缺乏大鼠甲狀腺腫模型[10]。造模后，除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組外各組大鼠均按10 mL·kg-1ig相應(yīng)藥物(按人的常規(guī)日劑量與體表面積折算)，每日1次，連續(xù)給藥1個(gè)月，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組給予等體積雙蒸水。實(shí)驗(yàn)期間繼續(xù)給藥。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

給藥4周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括4天訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)和1天測(cè)試實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)中，每天訓(xùn)練4次，間隔3 min，每次訓(xùn)練120 s，訓(xùn)練時(shí)大鼠從4個(gè)不同象限面朝池壁放置，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s未能找到平臺(tái)，將其放置在平臺(tái)上20 s。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)后24 h相應(yīng)藥物移走平臺(tái)，進(jìn)行測(cè)試實(shí)驗(yàn)，測(cè)試時(shí)間為120 s，如大鼠120 s內(nèi)未爬上平臺(tái)，記為潛逃潛伏期120 s。每只大鼠測(cè)試4次，取平均值為平均逃避潛伏期，同時(shí)記錄大鼠120 s內(nèi)游泳總距離[11,12]。

2.3 樣本采集

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h，各組大鼠禁食12 h，處死大鼠，迅速取出腦、肝組織，冰盒上快速小心剝離出大鼠的海馬組織，分別用冰生理鹽水洗去血液，用濾紙拭干稱重，將所取組織保存于-80 ℃冰柜中待測(cè)。使用前取出海馬和肝組織室溫下解凍，加入冰冷無(wú)菌的生理鹽水中，在冰盒上研磨制成10%組織勻漿待測(cè)。

2.4 大鼠海馬組織CAT活力和MDA含量測(cè)定

用考馬斯亮蘭蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)，依據(jù)試劑盒說明分別測(cè)定大鼠海馬組織中CAT活力和MDA含量。

2.5 大鼠肝臟組織SOD、GSH-Px活性測(cè)定

用考馬斯亮蘭蛋白定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)，依據(jù)試劑盒說明分別測(cè)定大鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px活性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃芪及其發(fā)酵物對(duì)碘缺乏大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1結(jié)果可見，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出明顯的記憶功能障礙：在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，游泳總距離明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。而黃芪及其發(fā)酵物均可不同程度地對(duì)抗碘缺乏所致空間學(xué)習(xí)記憶障礙(P<0.01或P<0.05)，其中以黃芪發(fā)酵物4.00 g生藥·kg-1劑量的作用最佳。

3.2 黃芪及其發(fā)酵物對(duì)碘缺乏大鼠海馬組織CAT活力和MDA含量的影響

碘缺乏后大鼠海馬組織中CAT活力明顯降低(P<0.01)、MDA含量明顯增加(P<0.01)；黃芪及其發(fā)酵物對(duì)碘缺乏大鼠海馬組織中CAT活力明顯提高(P<0.01或P<0.05)，MDA含量明顯減少(P<0.01或P<0.05)，以黃芪發(fā)酵物4.00 g生藥·kg-1劑量的作用最佳。結(jié)果見表2。

3.3 黃芪及其發(fā)酵物對(duì)碘缺乏大鼠肝臟組織SOD、GSH-Px活性的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝臟組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，黃芪及其發(fā)酵物組肝臟組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性明顯升高(P<0.01或P<0.05)，且均呈劑量依賴性，其中以黃芪發(fā)酵物4.00 g生藥·kg-1劑量的作用最佳。見表3。

組別劑量(g·kg-1)平均逃避潛伏期(s)游泳總距離(cm)正常對(duì)照組/21.95±7.39203.94±111.95模型對(duì)照組/38.59±15.18??471.57±145.04??黃芪423.80±12.17#261.14±95.76##黃芪233.09±19.50323.89±125.31#黃芪136.49±24.20430.91±106.77黃芪發(fā)酵421.42±10.02##235.75±89.96##黃芪發(fā)酵229.01±13.35296.85±93.12##黃芪發(fā)酵136.10±13.21437.14±115.05

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別劑量(g·kg-1)CAT(U·mgprot-1)MDA(nmol·mgprot-1)正常對(duì)照組/18.02±2.115.35±0.20模型對(duì)照組/11.06±1.60??6.52±0.52??黃芪416.40±3.97##5.63±0.49##黃芪213.97±4.006.03±0.28#黃芪111.73±3.746.43±0.37黃芪發(fā)酵417.70±4.23##5.46±0.22##黃芪發(fā)酵214.36±3.99#5.91±0.20##黃芪發(fā)酵111.87±2.976.31±0.59

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

組別劑量(g·kg-1)SOD(U·mgprot-1)GSH-Px(U·mgprot-1)正常對(duì)照組/251.80±3.76512.12±25.91模型對(duì)照組/227.10±5.96??315.22±23.63??黃芪4244.43±4.79##479.77±10.91##黃芪2234.58±7.53#381.29±16.10##黃芪1230.80±9.12323.98±14.27黃芪發(fā)酵4250.01±2.84##494.89±22.74##黃芪發(fā)酵2238.74±13.93#408.35±21.62##黃芪發(fā)酵1233.17±8.25337.20±51.91

注：與正常對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4 討論

自由基學(xué)說表明自由基氧化功能與抗氧化功能失調(diào)導(dǎo)致體內(nèi)清除自由基的酶和非酶系統(tǒng)防御功能減退，進(jìn)一步使大腦病理生理改變及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為記憶功能衰退。多項(xiàng)研究表明[13]，大腦記憶功能與抗氧化功能密切相關(guān)。

正常條件下，甲狀腺具有強(qiáng)大的抗氧化系統(tǒng)，可維持機(jī)體氧化平衡，并保護(hù)甲狀腺免受氧化應(yīng)激損傷。甲狀腺激素的合成與代謝都伴隨自由基的產(chǎn)生，而碘是合成甲狀腺激素的必需元素，碘與甲狀腺氧化損傷密切相關(guān)[14]。當(dāng)機(jī)體缺碘導(dǎo)致甲狀腺疾病時(shí)，可引起甲狀腺氧化應(yīng)激反應(yīng)，如活性氧基團(tuán)(Reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，這可能是碘缺乏導(dǎo)致甲狀腺疾病的機(jī)制之一[15]。

黃芪是常用的中藥材，目前臨床上黃芪入藥多為傳統(tǒng)飲片，水煎煮后取濾液為藥用。選用最佳的發(fā)酵工藝，提高了黃芪的藥用價(jià)值[16]。研究發(fā)現(xiàn)黃芪及其發(fā)酵物改善碘缺乏所致學(xué)習(xí)記憶障礙作用可能與抗氧化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芪及其發(fā)酵物能增加碘缺乏大鼠體質(zhì)量和自主活動(dòng)次數(shù)，減少大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間及到達(dá)目的地總路程，表明其能改善碘缺乏大鼠記憶功能衰退的現(xiàn)象。

機(jī)體在組織和細(xì)胞中建立了一套完整的防御自由基的損傷和破壞抗氧化酶自由基損傷防御系統(tǒng)，CAT、MDA、SOD、GSH-Px即為其中的重要組成部分[17]。碘缺乏可造成海馬組織CAT活力顯著降低和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA含量顯著增加，肝臟組織SOD、GSH-Px活性顯著降低，而黃芪及其發(fā)酵物可提高機(jī)體抗氧化酶的活性，使甲狀腺組織免受過脂質(zhì)過氧化的破壞，減輕細(xì)胞的損傷狀態(tài)，進(jìn)而起到保護(hù)學(xué)習(xí)記憶功能的作用。

碘缺乏損傷可引起大鼠記憶功能障礙，而黃芪及其發(fā)酵物能明顯改善碘缺乏大鼠的記憶功能障礙，對(duì)氧化相關(guān)酶方面有明顯的改善作用，其中尤以黃芪發(fā)酵物的作用最佳，提示黃芪發(fā)酵物有可能開發(fā)成為甲狀腺疾病治療的新型藥物，可能有助于改善甲狀腺功能減退的愈后，降低碘缺乏所致甲狀腺功能減退的嚴(yán)重程度，使其更好地應(yīng)用于臨床。