劉鴻雁，李 波*，郝寶成，姜專(zhuān)基，劉 淵，梁 云

(1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

菠菜來(lái)源于藜科菠菜屬植物菠菜SpinaciaoleraceaL.，又稱(chēng)菠薐，既作蔬菜用，又可入藥，其入藥始載于《食療本草》，屬藥食同源類(lèi)植物，具有利五臟、通腸胃熱、解酒毒功效[1-2]。菠菜子是菠菜的果實(shí)，又稱(chēng)菠薐菜子，具有清肝明目、止咳平喘之效，主治風(fēng)火目赤腫痛、咳喘[3-4]。藥理研究表明菠菜提取物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗高血脂和降糖等活性[4-5]。菠菜在我國(guó)作為蔬菜有著悠久的栽培和食用歷史，在長(zhǎng)期的食用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)菠菜和菠菜子具有藥用屬性，菠菜和菠菜子作為蔬菜國(guó)內(nèi)外已有大量研究，作為藥用，古代本草學(xué)對(duì)其功效和使用方法等亦有大量記載，但對(duì)其現(xiàn)代藥學(xué)的系統(tǒng)性研究較少，尤其是菠菜子屬于民間習(xí)用藥材，其藥理作用雖有一定研究基礎(chǔ)，但不夠系統(tǒng)和深入，導(dǎo)致其藥用資源開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用受限。目前，隨著對(duì)菠菜子藥食同源開(kāi)發(fā)利用的增多，應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理及藥效進(jìn)行研究，為菠菜子的臨床合理應(yīng)用和藥材資源開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[6]。

中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，有著悠久的應(yīng)用和發(fā)展史。中藥材來(lái)源受地域和古代認(rèn)識(shí)水平所限，同一藥材的基原、產(chǎn)地加工和藥用部位往往在不同時(shí)期有不同的變化。目前，隨著科技的發(fā)展和對(duì)中藥研究的深入，中藥的毒性越來(lái)越受到重視，近年來(lái)很多臨床實(shí)踐和研究發(fā)現(xiàn)，由于對(duì)中藥材基原、炮制加工等認(rèn)識(shí)欠缺，造成臨床使用不當(dāng)，導(dǎo)致中藥在臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)事件頻發(fā)，對(duì)中藥的安全用藥和臨床使用造成很大影響。菠菜和菠菜子來(lái)源于同一植物的不同藥用部位[6]，菠菜子屬于古代傳統(tǒng)和民間習(xí)用藥材，故對(duì)其進(jìn)行初步安全性研究，以期為菠菜子的安全性和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

SPF級(jí)昆明小鼠：體重(20±2)g，雌雄各半，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0001)。SPF級(jí)SD大鼠：體重(120±2)g，雄性，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-0001)。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF級(jí)別。飼養(yǎng)方法：按組分籠飼養(yǎng)，小鼠每籠6只，自由進(jìn)食進(jìn)水；小鼠每籠5只，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.2 藥品和器材

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，批號(hào)：20180411，精確度0.000 1 g)；一次性使用無(wú)菌注射器(2 mL，鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)許可證：蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20010222號(hào))；二甲苯(天津市百世化工有限公司，批號(hào)：50180715)；水合氯醛(鄭州市德眾化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190315)；二甲苯(鄭州市德眾化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190315)；阿司匹林腸溶片(石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)：286190163)；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：170794)；菠菜子水提取物(蘭州市肺科醫(yī)院提供)；打孔器；棉球。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響

取SPF級(jí)昆明小鼠60只，隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、阿司匹林組0.30 g/kg、菠菜子水提取物0.75、1.50、3.00 g/kg劑量組，每組12只，雌雄各半，各組均以20 mL/kg灌胃給藥，溶媒對(duì)照組給與等體積超純水，1次/d，連續(xù)6 d。末次給藥后45 min，各組小鼠于右耳兩面均勻涂抹二甲苯0.05 mL，左耳不涂為對(duì)照。致炎后1 h頸椎脫臼處死小鼠，用直徑6 mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，取耳片于分析天平稱(chēng)重，按下式計(jì)算耳腫脹度及抑制率：

腫脹度(mg)=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

抑制率=(溶媒組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/溶媒組平均腫脹度×100%

2.2 對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

取SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組、醋酸地塞米松0.15 mg/kg和菠菜子水提取物0.5、1.0和2.0 g/kg劑量組，每組10只。用3.5%的水合氯醛麻醉，頸部剃毛，將2個(gè)高溫滅菌的棉球約75 mg植入大鼠雙側(cè)腋窩皮下，手術(shù)線縫合皮膚，注射氨芐青霉素1 mg/0.1 mL抗感染。各組大鼠于手術(shù)后第2天以10 mL/kg體重給藥劑量灌胃給藥，1次/d，連續(xù)9 d。末次給藥后1 h，頸椎脫臼處死小鼠，取出棉球，將棉球放入60 ℃烘箱中干燥12 h，稱(chēng)重，減去原棉球質(zhì)量即為肉芽?jī)糁亍?/p>

由于所形成的肉芽組織易向棉球纖維內(nèi)浸潤(rùn)，在剝離肉芽腫組織時(shí)應(yīng)小心，否則影響其準(zhǔn)確性。由于棉球的表面積對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較大，為了減少差異，植入每只大鼠的棉球形狀和植入部位應(yīng)相似。

2.3 菠菜子水提取物急性毒性試驗(yàn)

2.3.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 取昆明小鼠40只，隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組和菠菜子水提取物(最大耐受量組以4的倍數(shù)共計(jì)設(shè)置4組：20 000 mg/kg、5 000 mg/kg、1 250 mg/kg、312.5 mg/kg)，每組8只，雌雄各半，連續(xù)觀察7 d，詳細(xì)記錄動(dòng)物毒性反應(yīng)情況和死亡情況，計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)的置信區(qū)間。

2.3.2 最大耐受量試驗(yàn) 取昆明小鼠40只，隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組和菠菜子水提取物最大耐受量(20 000 mg/kg，濃度1 g/mL)，每組20只，雌雄各半。各組均以0.4 mL/20 g灌胃給藥，給藥后2 h、4 h連續(xù)觀察小鼠有無(wú)毒性反應(yīng)及死亡情況，連續(xù)觀察7 d，主要觀察小鼠飲食、外觀、行為活動(dòng)、分泌物、排泄物等是否有異常，死亡情況，中毒反應(yīng)癥狀及起始時(shí)間、嚴(yán)重程度、持續(xù)時(shí)間、是否可逆及恢復(fù)時(shí)間等。分別于0 d、7 d稱(chēng)重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死存活小鼠，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器有無(wú)異常及明顯病變。

3 結(jié)果與分析

3.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)用LSD檢驗(yàn)，兩兩比較方差不齊時(shí)用Tamhane檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2 對(duì)二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菠菜子水提取物能抑制二甲苯致小鼠耳腫脹，抑制率分別為低劑量組25.62%，中劑量組7.17%，高劑量組48.10%。菠菜子水提取物低劑量組和中劑量組與溶媒對(duì)照組相比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且各劑量組未表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，其中，菠菜子水提取物高劑量組與溶媒對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示菠菜子水提取物高劑量組具有抗炎、消腫作用，其抗炎機(jī)制需進(jìn)一步研究。與阿司匹林陽(yáng)性組比較，菠菜子水提取物各劑量組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示菠菜子水提取物各劑量組的抗炎消腫作用與陽(yáng)性藥阿司匹林組相當(dāng)，見(jiàn)表1。

組別n劑量(g/kg)腫脹度(mg)抑制率(%)溶媒對(duì)照組12-7.6750±2.83681-阿司匹林陽(yáng)性組120.306.1417±2.5393119.90菠菜子低劑量組120.755.7083±3.5287025.62菠菜子中劑量組121.507.1250±2.412897.17菠菜子高劑量組123.003.9833±2.07050?48.10

注：與溶媒對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.3 對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響

直觀分析發(fā)現(xiàn)：各劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫的影響為高劑量組>中劑量組>低劑量組，但各劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。菠菜子水提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組與溶媒對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且各劑量組未表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性。與醋酸地塞米松陽(yáng)性組比較，菠菜子水提取物各劑量組的抑制作用相當(dāng)(P>0.05)，見(jiàn)表2。

組別n劑量(mg/kg)肉芽比率(%)溶媒對(duì)照組10-2.9258±2.1674醋酸地塞米松陽(yáng)性組100.152.5012±1.600菠菜子水提取物低劑量組105003.5010±1.1282菠菜子水提取物中劑量組1010002.5401±1.7836菠菜子水提取物高劑量組1020002.3489±0.8656

注：與溶媒對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.4 菠菜子水提取物急性毒性預(yù)試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各劑量組小鼠無(wú)死亡發(fā)生，小鼠精神狀態(tài)良好，未觀察到明顯中毒現(xiàn)象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見(jiàn)明顯病變及異常。

通過(guò)對(duì)各組小鼠的體重變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明各組小鼠的體重增長(zhǎng)與溶媒對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見(jiàn)表3。

組別性別體重0d7d溶媒對(duì)照組♂20.73±0.8122.56±2.27♀21.49±0.4634.24±3.29312.5mg/kg組♂20.42±1.2923.92±1.27♀20.96±1.3933.27±1.621250mg/kg組♂21.09±0.2522.30±0.19♀21.33±0.7333.43±1.895000mg/kg組♂21.05±0.9624.11±2.24♀19.67±1.3432.75±2.7920000mg/kg組♂20.01±0.7222.64±0.73♀21.19±0.5634.04±2.16

3.5 最大耐受量試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)期內(nèi)各劑量組小鼠無(wú)死亡發(fā)生，小鼠精神狀態(tài)良好，未觀察到明顯中毒現(xiàn)象，解剖肉眼觀察心肝脾肺腎、腎上腺、胸腺、卵巢、子宮、精囊、前列腺、睪丸、胃腸等臟器未見(jiàn)明顯病變及異常。

通過(guò)對(duì)兩組小鼠的體重變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明最大耐受組小鼠的體重增長(zhǎng)與溶媒對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，小鼠的體重變化情況見(jiàn)表4。

組別性別體重0d7d溶媒對(duì)照組♂21.18±0.9728.66±5.49♀21.45±0.3932.15±2.87最大耐受組♂21.02±0.6129.73±6.55♀21.41±0.5728.84±1.91

4 討論

本試驗(yàn)依據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[7]《中藥制劑的急性毒性試驗(yàn)》[8]對(duì)菠菜子水提取物小鼠急性毒性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)菠菜子水提物的安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：給藥組小鼠在各自劑量下均未出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，也無(wú)死亡發(fā)生，尸檢未發(fā)現(xiàn)各臟器異常。給藥組小鼠的體重增長(zhǎng)與溶媒對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。小鼠在20 000 mg/kg體重的劑量下沒(méi)有產(chǎn)生毒性作用，根據(jù)中藥毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可確定為實(shí)際無(wú)毒。本試驗(yàn)未能測(cè)出該制劑的LD50，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠對(duì)菠菜子水提取物的最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)為20 000 mg/kg體重，且沒(méi)有產(chǎn)生毒性作用，根據(jù)中藥毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可認(rèn)為菠菜子安全性較好，但由于本研究采用的是水提物，對(duì)于菠菜子中其他有效化學(xué)成分或有效部位的安全性還需做進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

炎癥是機(jī)體受到外傷、感染等損傷因子的刺激產(chǎn)生的一種以防御為主，損傷與抗損傷并存的基本病理過(guò)程。炎癥通常會(huì)改變機(jī)體的正常生理指標(biāo)，誘發(fā)多種急、慢性炎癥疾病，并使含血管系統(tǒng)的生物機(jī)體產(chǎn)生復(fù)制的防御反應(yīng)，炎癥是一種病理過(guò)程，早期(急性炎癥)主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn)、滲出和水腫，中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細(xì)胞游走，晚期為肉芽組織增生。二甲苯所致小鼠耳廓腫脹是研究急性炎癥常用的模型，而大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)是研究慢性炎癥常用的模型。本實(shí)驗(yàn)從不同炎癥發(fā)展的不同階段選取了兩種模型進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩種抗炎模型中隨著藥物濃度增加，藥效未相應(yīng)增加，說(shuō)明藥物效應(yīng)達(dá)到飽和的程度后，再繼續(xù)增加藥物濃度，其效應(yīng)不會(huì)再增加，即菠菜子水提取物可能是一種時(shí)間依賴(lài)性的物質(zhì)，決定療效的重要因素取決于時(shí)間。綜上，菠菜子水提取物具有良好的抗炎活性且安全無(wú)毒，在防治急慢性炎癥、腹腔感染性疾病等方面具有很大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。目前，菠菜子的應(yīng)用受限，今后應(yīng)系統(tǒng)研究其安全性和有效性，需從多途徑多通路入手，包括HPAA系統(tǒng)、花生四烯酸代謝系統(tǒng)、炎癥因子、抗血栓、氧自由基清除等方面，在分子水平上探討其抗炎作用機(jī)制，為菠菜子的臨床合理應(yīng)用及資源開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。