(四川省人民醫(yī)院東院乳腺甲狀腺外科，四川 成都 610000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有上升趨勢(shì)[1]。盡管乳腺癌的篩查和治療取得了一定進(jìn)展，但仍然是女性因癌癥死亡的主要疾病之一。目前的研究表明，乳腺癌的發(fā)生與遺傳因素、免疫失調(diào)、激素紊亂有關(guān)，其發(fā)生、發(fā)展與多種抑癌基因與促癌因子比例失調(diào)密切相關(guān)，但其主要的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[2]，因此闡明乳腺癌發(fā)病機(jī)理及其相關(guān)分子機(jī)制，尋找新的治療策略尤為重要。

microRNA(miR)是一類長(zhǎng)度為18～24 nt的非編碼短鏈RNA，不直接編碼蛋白，而是通過調(diào)控目的基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[3]。miR-200b(miRBase ID：MIMAT0000318)是miR-200家族成員之一，在多種內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和癌細(xì)胞中有表達(dá)，并廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為[4-5]。miR-200b家族在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，可抑制癌細(xì)胞增殖和遷移[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌中的表達(dá)均有降低，但具體機(jī)制尚未闡明[7-9]。程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death factor4,PDCD4)是近年來發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因之一，與miR-200b在胃癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，抑制胃癌細(xì)胞miR-21的表達(dá)后可上調(diào)表達(dá)，發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用，且PDCD4的下調(diào)與雌激素受體陽性乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)[10-11]。然而，miR-200b與PDCD4在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中是否起到關(guān)鍵作用尚不清楚，因此，本研究測(cè)定miR-200b在乳腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PDCD4和miR-200b結(jié)合序列的相似關(guān)系，進(jìn)一步研究miR-200b和PDCD4在乳腺癌細(xì)胞株中的調(diào)控關(guān)系及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，為闡明乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本采集與處理

收集2017年6月至2018年2月在我院經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌的患者標(biāo)本(腫瘤組織及癌旁組織43例)。離體后迅速放入液氮罐中低溫保存。所有患者術(shù)前未行化療、放療、基因靶向治療，乳腺癌為原發(fā)病灶并經(jīng)病理科證實(shí)。本研究通過我院倫理委員會(huì)審批，術(shù)前患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株與主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞HCC38、MCF-7、MDA-MB-231及人乳腺正常上皮細(xì)胞MCF10A均購(gòu)于美國(guó)ATCC公司，1640培養(yǎng)液、特級(jí)胎牛血清、雙抗溶液及OPTI-ME購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。PDCD4兔抗、GAPDH兔抗、二抗山羊抗兔均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。miR-200b qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)于上海吉瑪基因有限公司。Lipo2000試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司?；|(zhì)膠(Matrige1)購(gòu)于美國(guó)BD公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Costar公司。miR-200b-siRNA、PDCD4-mimics及對(duì)照miRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P制藥技術(shù)有限公司。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、高靈敏ECL化學(xué)放光試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染分組 將HCC38、MCF-7、MDA-MB-231、MCF10A細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，條件：溫度37 ℃，5%CO2。轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞以50%～60%的密度接種于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。根據(jù)培養(yǎng)手冊(cè)，使用Lipofectamine RNAiMax將miR-200b siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后將PDCD4 mimics轉(zhuǎn)染到已轉(zhuǎn)染miR-200b siRNA的MCF-7細(xì)胞中。將細(xì)胞分為4組，轉(zhuǎn)染miR-200b siRNA的MCF-7細(xì)胞為miR-200b實(shí)驗(yàn)組，未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞為miR-200b對(duì)照組，同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-200b和PDCD4蛋白的MCF-7細(xì)胞為PDCD4實(shí)驗(yàn)組，只轉(zhuǎn)染miR-200b的MCF-7細(xì)胞為PDCD4對(duì)照組。

1.3.2 RNA提取和熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-200b的表達(dá) Trozel法提取組織及細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增miR-200b，使用GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：以100 ng總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min。然后根據(jù)PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。獲得數(shù)據(jù)以RQ=2-ΔΔCT計(jì)算mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。miR-200b上游引物：5′-TGCCGTAATACTGCCTGGTAA-3′；下游引物：5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′。GAPDH內(nèi)參上游引物：5′-GGTCGGGCAGGAAAGAGGGC-3′；下游引物：5′-CTAATCTTCTCTGTATCGTTCC-3′。PDCD4上游引物：5′-AAGAAAGGTGGTGCAGGAGG-3′；下游引物：5′-TGACTAGCCTTCCCCTCCAA-3′。

1.3.3 雙熒光素酶活性測(cè)定 miR-200b和PDCD4重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中。分組如下：miR-200b siRNA+Wt PDCD4、miR-200b NC+Wt PDCD4、miR-200b siRNA+Mut PDCD4、miR-200b NC+Mut PDCD4。根據(jù)siPORTneoFX使用方法操作，在轉(zhuǎn)染后48 h 制備裂解物。然后根據(jù)說明書，使用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行熒光素酶分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDCD4的表達(dá)水平 提取蛋白后，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離等量的蛋白質(zhì)。將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h。PDCD4一抗(1∶1 000)在4 ℃下孵育溫育過夜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h，最后使用ECL顯影液檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。使用GAPDH作為蛋白對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活性 使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞的活性。將經(jīng)過轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞接種在96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后加入20 μL的CCK-8溶液，并在37 ℃下孵育4 h。使用酶標(biāo)儀板在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量不同組的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠在4 ℃環(huán)境中過夜融化，與3倍體積的無血清培養(yǎng)基混合均勻后加入24孔Transwell小室(每孔50 μL)。復(fù)溫30 min后，將250 mL 10%FBS、1640加入下室中，并且將1×105個(gè)細(xì)胞種植在上室中，在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng) 24 h。利用棉簽輕微地清潔膜上表面的細(xì)胞，穿透聚碳酸酯膜的細(xì)胞用甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲到下側(cè)的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人乳腺癌組織及不同乳腺癌細(xì)胞株中miR-200b表達(dá)水平的比較

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，miR-200b在乳腺癌組織中的表達(dá)低于正常乳腺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1a。HCC38、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株中miR-200b的表達(dá)水平高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF10A，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1b；MCF-7細(xì)胞株相對(duì)于HCC38和MDA-MB-231細(xì)胞株中miR-200b的表達(dá)水平較高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取乳腺癌MCF-7細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

a：miR-200b在不同組織中的表達(dá)水平 *：與正常組織比較，P<0.05; b:miR-200b在不同細(xì)胞株中的表達(dá)水平 *：與MCF10A比較，P<0.05

圖1 人乳腺癌組織及不同乳腺癌細(xì)胞株中miR-200b表達(dá)水平的比較

2.2 miR-200b和PDCD4在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中的調(diào)控關(guān)系

采用TargetScan、PicTar4和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-200b進(jìn)行檢索，預(yù)測(cè)其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-200b和PDCD4間有部分相同的結(jié)合序列(圖2a)。因此通過雙熒光素酶報(bào)告基因明確miR-200b和PDCD4間的調(diào)控關(guān)系。將miR-200b siRNA、PDCD4 3′-UTR共轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示：與miR-200b NC+Mut PDCD4相比，miR-200b siRNA+Mut PDCD4的熒光素酶活性顯著增高;抑制miR-200b的表達(dá)后，PDCD4的表達(dá)及活性相應(yīng)上調(diào)[(1.51±0.33)vs.(1.22±0.15)，P<0.001]，見圖2b。

a:miR-200b和PDCD4間有部分相同的結(jié)合序列;b:雙熒光素酶報(bào)告基因明確miR-200b和PDCD4間的調(diào)控關(guān)系 *：與miR-200b siRNA Mut PDCD4比較，P<0.001

圖2 miR-200b和PDCD4在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中的調(diào)控關(guān)系

2.3 miR-200b對(duì)MCF-7細(xì)胞株P(guān)DCD4蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制miR-200b表達(dá)后，PDCD4蛋白表達(dá)含量下降(P<0.05)，見圖3a；并且抑制miR-200b表達(dá)后，與miR-200b siRNA+Wt PDCD4組相比，miR-200b NC+Wt PDCD4組的MCF-7細(xì)胞增殖率增高[(0.66±0.19)vs.(0.92±0.25)，P<0.05]，見圖3b。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)36 h后，miR-200b siRNA+Wt PDCD4和miR-200b NC+Wt PDCD4侵襲至Transwell小室下的MCF-7乳腺癌細(xì)胞分別為(245.71±21.04)個(gè)和(449.39±39.17)個(gè)，表明抑制miR-200b表達(dá)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞株細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)(P<0.05)，見圖3c。

2.4 PDCD4對(duì)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)DCD4蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)PDCD4表達(dá)后，PDCD4蛋白表達(dá)含量上調(diào)(P<0.05)，圖4a；增強(qiáng)PDCD4表達(dá)后，與miR-200b NC+Mut PDCD4組相比，miR-200b siRNA+Mut PDCD4組MCF-7細(xì)胞增殖率降低[(0.63±0.15)vs.(0.34±0.09)，P<0.05]，見圖4b。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)36 h后，miR-200b siRNA+Mut PDCD4和miR-200b NC+Mut PDCD4侵襲至Transwell小室下的MCF-7乳腺癌細(xì)胞分別為(265.71±18.21)個(gè)和(142.33±16.29)個(gè)，表明增強(qiáng)PDCD4表達(dá)后，乳腺癌MCF-7細(xì)胞株細(xì)胞侵襲能力減弱，見圖4c。

a:miR-200b對(duì)PDCD4蛋白表達(dá)的影響;b:miR-200b對(duì)細(xì)胞活性的影響;c:miR-200b對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 *：與miR-200b NC+Wt PDCD4比較，P<0.05

圖3 miR-200b對(duì)MCF-7細(xì)胞株P(guān)DCD4蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

a:PDCD4蛋白表達(dá)的變化;b:PDCD4對(duì)細(xì)胞活性的影響;c:PDCD4對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 *：與miR-200b siRNA+Mut PDCD4比較，P<0.05

圖4 PDCD4對(duì)乳腺癌細(xì)胞株P(guān)DCD4蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

3 討論

乳腺癌在女性癌癥中發(fā)病率居首位，居高不下的發(fā)病率以及腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是目前關(guān)注的重點(diǎn)，雖然已有大量的學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，但尚無統(tǒng)一的定論[12]。目前研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，通過與靶基因的3′-UTR結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)或沉默復(fù)合體，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平對(duì)靶基因進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響[13]。Liu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)miR-214可通過促進(jìn)PENT基因的表達(dá)，從而抑制骨肉瘤的增殖及轉(zhuǎn)移。Shrestha等[15]的研究表明，miR-204在胃癌中可同時(shí)對(duì)CKS1B、CXCL1及GPRC5A基因進(jìn)行調(diào)控，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖與凋亡。因此，尋找惡性腫瘤中特異性表達(dá)的miRNA及其調(diào)控的下游靶基因，再轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行外源性調(diào)控，可能是治療惡性腫瘤新的突破口。

miRNA正在成為各種基本生物過程中的關(guān)鍵參與者，并且其表達(dá)改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移特異性相關(guān)。miR-200b在許多癌癥中過度表達(dá)，如乳腺癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌，是惡性腫瘤預(yù)后的負(fù)面因素，與轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)[16-18]。miR-200家族基因主要由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429組成，自Gregory等[16]首次發(fā)現(xiàn)miR-200家族在惡性腫瘤中的表達(dá)呈抑制狀態(tài)以來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miR-200家族通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化從而用抑制腫瘤新生的血管支持自身的能力，阻斷腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[17]。對(duì)于肺癌、卵巢癌、腎癌或三陰性乳腺癌，體內(nèi)miR-200家族基因高表達(dá)的患者生存期較低表達(dá)患者長(zhǎng)，其中miR-200a在三陰性乳腺癌患者體內(nèi)明顯降低，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌細(xì)胞株中表達(dá)降低，通過抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡，從而抑制乳腺癌的進(jìn)展，但具體機(jī)制至今仍未闡明[18-19]。PDCD4是新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞凋亡相關(guān)基因。Shibahara等[20]于1995年在小鼠身上成功克隆PDCD4，發(fā)現(xiàn)其功能上可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的程序性死亡，也通過抑制蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯過程抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Kamel等[21]研究表明，PDCD4與microRNA-21在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過上調(diào)PDCD4的表達(dá)，能夠發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。而miR-200b與PDCD4在乳腺癌中的表達(dá)以及是否在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用還未見報(bào)道，因此本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn)乳腺癌及正常乳腺組織中miR-200b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-200b在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，進(jìn)一步抑制miR-200b的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著增強(qiáng)，表明miR-200b是乳腺癌細(xì)胞中的抑癌基因，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲。

本研究采用TargetScan、PicTar4和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miR-200b進(jìn)行檢索，預(yù)測(cè)其靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-200b和PDCD4間有部分相同的結(jié)合序列，推測(cè)PDCD4是miR-200b在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用的靶基因，故通過雙熒光素酶報(bào)告基因明確miR-200b和PDCD4間的調(diào)控關(guān)系。本研究將miR-200b siRNA、PDCD4 3′-UTR共轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，結(jié)果顯示抑制miR-200b的表達(dá)后，PDCD4的表達(dá)及活性相應(yīng)上調(diào)，乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力明顯增強(qiáng)，并且同時(shí)過表達(dá)PDCD4后PDCD4蛋白表達(dá)含量增加，乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力比之前降低，說明miR-200b可調(diào)控PDCD4基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其是否特異性靶向調(diào)控下游基因或蛋白進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為還不得而知，也是本實(shí)驗(yàn)今后繼續(xù)研究的方向。

綜上所述，miR-200b可調(diào)控PDCD4基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)為miR-200b在乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用方式和機(jī)制的闡釋提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為乳腺癌的診斷和治療開辟新的治療靶點(diǎn)提供可能。