劉 晨，楊藝煒，王家哲，常 青，洪 波，張 鋒

(陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043)

馬鈴薯俗稱土豆，作為全球第四大糧食作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位[1]。但中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)一直飽受病害困擾，馬鈴薯病害嚴(yán)重制約國(guó)內(nèi)馬鈴薯單位面積產(chǎn)量的提升以及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，目前陜西省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)面臨著同樣問(wèn)題。甘薯已經(jīng)成為中國(guó)許多省(區(qū))調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要作物，甘薯在陜西省也逐步成為重要經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)于帶動(dòng)區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義。馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)(Ditylenchusdestructor)也被稱為Potato nematode，最初發(fā)現(xiàn)于馬鈴薯上，是其貯藏期一種重要病害[2]，也是嚴(yán)重為害馬鈴薯的重要病原之一[3]。在中國(guó)，馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)首次在甘薯上被分離出來(lái)，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成80%以上的減產(chǎn)，甚至絕收[4-5]。此外，腐爛莖線蟲(chóng)還可為害蠶豆、小麥、當(dāng)歸、三七等幾十種農(nóng)作物及中藥材[6]。

馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)目前主要分為2類基因型，有文獻(xiàn)[7]報(bào)道這2個(gè)基因型在尾長(zhǎng)、C值、V值等形態(tài)特征值上存在顯著差異。2007年，有學(xué)者[8]對(duì)多個(gè)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)種群的核糖體ITS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)不同地理種群明顯分為2個(gè)生物型，即A型和B型這兩種。此外，還有多篇文獻(xiàn)也證實(shí)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)種群中存在2類基因型這一結(jié)論[9-11]。有國(guó)外學(xué)者將不同寄主作物上的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)群體分為A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型這7個(gè)不同生物型[12-13]。A型僅在中國(guó)發(fā)現(xiàn)，且只為害甘薯，B型和E型主要為害甘薯和馬鈴薯，C型寄主為馬鈴薯、甘薯及大蒜，D型可侵染大蒜，F(xiàn)型在甘薯和黃芪上有分離出來(lái)，G型為害馬鈴薯。

1925年，馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)首次在美國(guó)甘薯上被發(fā)現(xiàn)[14]，傳入中國(guó)后，在北京、山東、河北等甘薯生產(chǎn)區(qū)均造成嚴(yán)重為害[15]。馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)在國(guó)外主要為害馬鈴薯，在國(guó)內(nèi)主要為害甘薯，但近幾年，在甘肅等地也發(fā)現(xiàn)此線蟲(chóng)為害馬鈴薯[16-18]。因此，明確該病原線蟲(chóng)的生物型及系統(tǒng)發(fā)育地位，可為其致病性研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為馬鈴薯及甘薯生產(chǎn)區(qū)腐爛莖線蟲(chóng)的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年3月至12月期間，馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)采自陜西省榆林市定邊縣、靖邊縣、神木縣及榆陽(yáng)區(qū)的馬鈴薯發(fā)病田，及陜西省渭南市合陽(yáng)縣及興平市的甘薯發(fā)病田。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲(chóng)的分離 將不同地區(qū)采集病薯的典型病塊區(qū)切下，切成1 cm×1 cm小塊，清水沖洗干凈，取雙層面巾紙將其包住，采用漏斗分離線蟲(chóng)。收集到的線蟲(chóng)用0.5%次氯酸鈉浸泡、消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3遍，保存，備用。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定、線蟲(chóng)標(biāo)本制作及特征值測(cè)量 將分離得到的腐爛莖線蟲(chóng)懸浮液，置于65 ℃水浴處理0.5 min熱力殺死[19-21]，并制成玻片以供觀察。應(yīng)用EZcam軟件，在顯微鏡下對(duì)腐爛莖線蟲(chóng)的主要形態(tài)特征進(jìn)行觀察、測(cè)量及拍照。主要測(cè)量數(shù)據(jù)包括線蟲(chóng)的體長(zhǎng)(L)、體寬(W)、口針長(zhǎng)度(S)、頭長(zhǎng)(H)、尾長(zhǎng)(T)等[22]，對(duì)比不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)在形態(tài)上的差異。每組測(cè)量20條線蟲(chóng)，計(jì)算平均值。

掃描電鏡觀察：將線蟲(chóng)置于裝有5%戊二醛的離心管中于4 ℃下固定3 h，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲(chóng)，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行沖洗之后，在3 000 r/min下離心2 min，棄上清，留下層的線蟲(chóng)，用超聲波清洗儀將線蟲(chóng)于30 ℃條件下清洗30 min，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)依次為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脫水，每級(jí)脫 8 min，離心2 min。再依次用乙酸異戊酯與無(wú)水乙醇體積比分別為1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的乙酸異戊酯與無(wú)水乙醇混合液置換，每步置換6 min，離心2 min，EMITECH-K850型臨界點(diǎn)干燥儀干燥，MSP-1S型離子濺射儀噴金鍍膜，在HITACHI-3400N型掃描電子顯微鏡下觀察并照相。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定提取線蟲(chóng)DNA 向1.5 mL離心管內(nèi)加入16 μL×PCR Buffer(去Mg2+)、4 μL蛋白酶K、40 μL ddH2O，再將線蟲(chóng)放入混合液中；將離心管置于液氮中研磨，反復(fù)研磨3次；離心管水浴65 ℃保溫90 min；再放置 85 ℃金屬浴10 min，取出放至室溫即可用于PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增條件：反應(yīng)選取腐爛莖線蟲(chóng)線粒體COI通用引物、核糖體ITS通用引物及A型生物型及B型生物型的特異性引物(表1)。

表1 用于鑒定馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的引物Table 1 Primers of Ditylenchus destructor

PCR反應(yīng)體系為2×TaqMix 25 μL(上海生工)，20 μmol/L上游引物2 μL，20 μmol/L下游引物2 μL，DNA模板2 μL，H2O補(bǔ)充總體積至50 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)為95 ℃預(yù)變性4 min， 94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司，進(jìn)行測(cè)序(Sanger 測(cè)序)。利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法(Neighbour-Joining, NJ)分別對(duì)線粒體COⅠ及核糖體ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐爛莖線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定

在40倍顯微鏡下觀察可見(jiàn)，雌性腐爛莖線蟲(chóng)溫?zé)崴劳龊笙x(chóng)體略向腹部彎曲，蟲(chóng)體表角質(zhì)膜上有細(xì)環(huán)紋，環(huán)距1 μm ，唇區(qū)低且平滑，稍突出于體外，頭區(qū)與體軀之間有一輕微的溢縮。蟲(chóng)體側(cè)寬約占整體寬的1/5 ，側(cè)線6 條(圖1)。食道屬墊刃型，口針細(xì)小，長(zhǎng)10～13 μm ，口針基球小而明顯，呈圓形(圖2)。中食道球卵圓形，肌肉質(zhì)，具瓣門。狹部窄，其上環(huán)繞神經(jīng)環(huán)。后食道腺體從背面或側(cè)面交蓋腸的前端，約交蓋半個(gè)體寬至1 個(gè)體寬。后陰子宮囊明顯，其長(zhǎng)度一般為陰門到肛門距離的2/3。卵母細(xì)胞在近子宮處單行排列。后陰子宮囊長(zhǎng)約達(dá)陰門至肛門距離的3/4 位置處。尾圓錐形，略向腹部彎，尾端細(xì)圓(圖2)。

雄蟲(chóng)蟲(chóng)體前端形態(tài)與雌性蟲(chóng)形態(tài)相似，尾略窄，尾端細(xì)圓；交合刺略向腹部彎曲。交合傘始于交合刺前端相對(duì)應(yīng)的位置，向后伸約尾長(zhǎng)的75%，基部膨大, 其寬處有2個(gè)指狀突起；引帶簡(jiǎn)單且短(圖2)。

2.2 不同生物型腐爛莖線蟲(chóng)特征值測(cè)量

對(duì)不同生物型的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)雌、雄成蟲(chóng)各測(cè)量20頭，測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表2。

A.6面輻射狀唇片；B.交合傘始于交合刺前端；C.體中側(cè)區(qū)6條側(cè)線

A.Six radial labrum; B.Copulatory bursa begins at the front of speculum; C.Six lateral lines of middle body side

圖1 馬鈴薯莖線蟲(chóng)掃描電鏡照片
Fig.1 Stereoscan photograph ofDitylenchusdestructor

A.雄蟲(chóng)交合刺側(cè)面及交合傘；B.交合刺腹面及指狀；C.雌蟲(chóng)陰門及尾部；D.頭部溢縮及口針；標(biāo)尺：A/B/C=25 μm，D=10 μm

A.Spiculum lateral surface and copulatory bursa of male; B.Segmental venter and finger of speculum; C.Cunnus and tail of female; D.Excessive shrinkage and lancet of head; scaleplate:A/B/C=25μm，D=10μm

圖2 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)顯微鏡下特征形態(tài)Fig.2 Characteristic morphology under microscope of Ditylenchus destructor

注：a=體長(zhǎng)/體寬；b=體長(zhǎng)/體前部至腸前端距離；c=體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)；V=體前端至陰門距離×100/體長(zhǎng)。

Note:a=Length/width;b=Length/distance from anterior body to anterior intestine;c=Length/Tail;V=Distance from anterior end of body to vulva×100/length.

從表2可以看出，無(wú)論B型還是A型腐爛莖線蟲(chóng)的雌成蟲(chóng)均比雄成蟲(chóng)體長(zhǎng)長(zhǎng)，體寬也略寬，合陽(yáng)與興平的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)雌成蟲(chóng)與雄成蟲(chóng)在體長(zhǎng)、a值、b值、c值及V值之間差異不顯著，B型腐爛莖線蟲(chóng)雌成蟲(chóng)與雄成蟲(chóng)的體長(zhǎng)均比A型的顯著減小，雌成蟲(chóng)的V值B型比A型小，但a值B型高于A型，b值、c值差異不顯著。測(cè)量結(jié)果與郭全新等[19]、劉維志等[20]的測(cè)量結(jié)果基本一致。

2.3 腐爛莖線蟲(chóng)分子鑒定

2.3.1 不同地區(qū)莖線蟲(chóng)線粒體COI及核糖體ITS通用引物檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的線粒體通用引物擴(kuò)增陜北及關(guān)中合陽(yáng)、興平的線蟲(chóng)群體，從凝膠成像結(jié)果來(lái)看，所有樣品都擴(kuò)增出480 bp條帶(圖3)。用馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)ITS通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，為害陜北馬鈴薯的莖線蟲(chóng)均有約950 bp的條帶，關(guān)中合陽(yáng)、興平甘薯上莖線蟲(chóng)均擴(kuò)增出約760 bp的條帶(圖4)。因此可以確定所有這些線蟲(chóng)樣品均為馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)。

2.3.2 不同地區(qū)腐爛莖線蟲(chóng)生物型鑒定結(jié)果 為確定不同地區(qū)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的生物型是否相同，選取A型與B型的特異性引物擴(kuò)增陜北、合陽(yáng)及興平的馬鈴薯種群。從圖5可以看出，榆林地區(qū)靖邊縣、定邊縣、神木縣及榆陽(yáng)區(qū)為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)，合陽(yáng)縣及興平市采集的為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)。

圖3 ITS區(qū)通用引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Universal primer amplification of rDNA-ITS

2.4 rDNA-ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)核糖體ITS通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI上BLAST比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，陜北B型種群與登錄號(hào)為JZ133363、JZ133338的B型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)群體同源性高達(dá)99.5%，關(guān)中A型種群與A型的MH992393的同源性高達(dá)99.1%。

使用腐爛莖線蟲(chóng)核糖體ITS通用引物對(duì)陜北不同地區(qū)、合陽(yáng)及興平的種群進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，利用MEGA6.0軟件，將這7個(gè)序列及NCBI上已知的5個(gè)序列號(hào)為JZ133363、JZ133338的B型及MH992393的A型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)種群分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖6)。從結(jié)果來(lái)看，種群DingB、JingB、ShenM及YuY的rDNA-ITS序列與已知序列MK979365、JZ133411聚為一支。XingP、HeY和 HeY2聚在一支。合陽(yáng)的兩個(gè)不同樣品遺傳距離最近，與興平種群親緣性高，這3個(gè)種群均為A型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)，陜北的定邊縣及靖邊縣的種群遺傳距離最近，與神木縣及榆陽(yáng)區(qū)的莖線蟲(chóng)種群親緣性較高，這4個(gè)種群均為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)。同時(shí)，此系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)成功將A型、B型兩個(gè)種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)成功區(qū)分開(kāi)。此結(jié)果與分子鑒定結(jié)果較為一致。

圖4 線粒體通用引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Universal primer amplification of mtDNA

圖5 A型、B型特異性引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Specific primer amplification of type A and B

圖6 馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.6 Phylogenetic tree of Ditylenchus destructorrDNA-ITS

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)中國(guó)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)rDNA-ITS序列對(duì)比可以看出，其種群主要分為A型和B型2個(gè)基因生物型[8,23]，但關(guān)于這2個(gè)生物型群體在形態(tài)特征、寄主范圍、病理學(xué)上等方面差異的研究較少[18]。本研究首次在陜西省發(fā)現(xiàn)該線蟲(chóng)為害馬鈴薯及甘薯，并首次對(duì)陜西不同地區(qū)、不同寄主上該線蟲(chóng)的生物型進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果顯示，侵染陜西省榆林馬鈴薯的為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)，侵染陜西省合陽(yáng)及興平甘薯的為A型。形態(tài)特征值的測(cè)量結(jié)果顯示，A型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)比B型的體長(zhǎng)長(zhǎng)，體寬略寬，雌成蟲(chóng)的V值較大，但a值B型馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)高于A型，b值、c值差異不顯著。不同地區(qū)相同生物型的莖線蟲(chóng)，在形態(tài)特征值上差異并不顯著。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，成功將A型、B型2個(gè)種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)區(qū)分開(kāi)。

有研究[18,23-24]表明：中國(guó)山東、河北及江蘇等地甘薯上馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)可分為A型、B型2個(gè)生物型；有學(xué)者[12]在此基礎(chǔ)上將馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)種群分為A-G型7個(gè)單元型，A-F單元型均在中國(guó)有發(fā)生，而G型并未發(fā)現(xiàn)。關(guān)于陜西省是否還存在馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的其他生物型，及不同生物型發(fā)生區(qū)域、侵染作物種類、生物特性及其他分子生物學(xué)方面是否存在差異，還需進(jìn)一步調(diào)查研究，這將對(duì)有效預(yù)防及控制馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)的擴(kuò)散提供理論依據(jù)。