馬煜明，玉 云，朱 雯，高玉佩，黃友誼

(1.華中農(nóng)業(yè)大學 園藝林學學院， 武漢 430070；2.貴州省貴陽市烏當區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴陽 550000)

黑茶是中國傳統(tǒng)六大茶類之一，有著悠久的生產(chǎn)和飲用歷史。近年來，隨著大眾養(yǎng)生觀念的加深，黑茶消費市場日益擴大[1-2]。黑茶渥堆發(fā)酵是由濕熱反應、微生物酶催化、微生物代謝共同作用完成。發(fā)酵過程以微生物作用為主導，形成黑茶的特殊風味品質[3-4]，因此微生物對黑茶品質的形成起關鍵性作用，且微生物種類不同會導致黑茶品質呈現(xiàn)顯著差異。目前，黑茶依然依賴于自然發(fā)酵生產(chǎn)，但發(fā)酵過程存在微生物種類不可控、衛(wèi)生安全問題突出、茶葉品質不穩(wěn)定等問題，迫切需要改進提升[5-6]。人工接種優(yōu)良菌株可促進黑茶安全生產(chǎn)和優(yōu)良品質的形成，但發(fā)酵工藝條件因菌株的不同而異[7-9]。已有的研究表明，荔枝產(chǎn)香菌能顯著改善發(fā)酵煙葉的品質[10]，為此，本研究基于課題組前期已篩選獲得適宜發(fā)酵茶葉的荔枝產(chǎn)香菌基礎上，分析不同發(fā)酵條件對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響，以優(yōu)化發(fā)酵工藝，為清潔化安全生產(chǎn)黑茶和開發(fā)新穎黑茶產(chǎn)品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

ZYF3為華中農(nóng)業(yè)大學茶學系茶葉加工與生物技術課題組從荔枝中篩選出來適宜于茶葉發(fā)酵的優(yōu)勢產(chǎn)香酵母菌株，青磚茶原料(綠毛茶)購自湖北洞莊茶業(yè)有限公司。葡萄糖、福林酚、甲醇、碳酸鈉、濃硫酸、磷酸氫二鈉等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 菌種液制備 ZYF3菌株接種于10 mL、20 g/L質量濃度的茶湯中，于28 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)5～6 d，得菌種液，用于接種發(fā)酵綠毛茶。

1.2.2 不同條件下發(fā)酵荔枝產(chǎn)香菌茶 (1)不同接種量下發(fā)酵產(chǎn)香菌茶：綠毛茶以20 g/瓶的標準裝瓶，121 ℃高溫滅菌20 min。在超凈工作臺內用移液槍吸取一定量的荔枝產(chǎn)香菌菌種液接種于滅菌茶樣中，菌株接種量設為0.9%、1.0%、 1.1%、1.2%、1.3%和1.4%(mL/g，菌種液體積/茶葉質量)，用無菌水補充水分，使茶坯最終含水量控制在40%，于28 ℃恒溫箱中發(fā)酵10 d，發(fā)酵結束后用40 ℃烘箱烘至足干，得發(fā)酵茶樣。

(2)不同茶坯含水量下發(fā)酵產(chǎn)香菌茶：綠毛茶以20 g/瓶的標準裝瓶，121 ℃高溫滅菌20 min。在超凈工作臺內用移液槍吸取1.0%(mL/g，菌種液體積/茶葉質量)的荔枝產(chǎn)香菌菌種液接種于滅菌茶樣中，茶坯含水量設為20%、30%、40%、45%、50%和60%，用無菌水補充水分，于28 ℃恒溫箱中發(fā)酵10 d，發(fā)酵結束后用40 ℃烘箱烘至足干，得發(fā)酵茶樣。

(3)不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵產(chǎn)香菌茶：綠毛茶以20 g/瓶的標準裝瓶，以121 ℃高溫滅菌20 min。在超凈工作臺內用移液槍吸取1.0%(mL/g，菌種液體積/茶葉質量)的荔枝產(chǎn)香菌菌種液接種于滅菌茶樣中，用無菌水補充水分，使茶葉最終含水量控制在40%，于恒溫箱中發(fā)酵10 d，發(fā)酵溫度設為20 ℃、25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃和45 ℃，發(fā)酵結束后用40 ℃烘箱烘至足干，得發(fā)酵茶樣。

(4)不同發(fā)酵時間下發(fā)酵產(chǎn)香菌茶：綠毛茶以20 g/瓶的標準裝瓶，以121 ℃高溫滅菌20 min。在超凈工作臺內用移液槍吸取1.0%(mL/g，菌種液體積/茶葉質量)的荔枝產(chǎn)香菌菌種液接種于滅菌茶樣中，用無菌水補充水分，使茶葉最終含水量控制在40%，于28 ℃恒溫箱中發(fā)酵，發(fā)酵時間設為5 d、10 d、15 d、20 d、25 d和30 d，發(fā)酵結束后用40 ℃烘箱烘至足干，得發(fā)酵茶樣。

1.2.3 茶葉感官審評方法 參考GB/T23776-2018中黑茶(散茶)審評方法，由5位專業(yè)評茶員進行審評，審評時為突出茶葉香氣，評分權數(shù)設置為：總分=香氣得分×40%+湯色得分×20%+滋味得分×30%+葉底得分×10%。

1.2.4 茶葉理化性狀測定方法 茶葉含水量的測定參照GB5009.3-2016直接干燥法，水浸出物含量的測定參照GB/T8305-2013，茶多酚含量的測定參照GB/T8313-2008福林酚比色法，游離氨基酸含量的測定參照GB/T8314-2013，可溶性糖的測定采用蒽酮比色法[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，采用 Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS軟件(PASW Statistics 18.0)進行方差分析和顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 接種量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響

2.1.1 接種量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質的影響 對不同接種量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶進行感官審評，結果見表1。由表1可知，隨著接種量增加，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶發(fā)酵香或菌香更加明顯。當接種量為1.2%時，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶香氣最協(xié)調，得分最高，但不同接種量的產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官得分相互之間沒有明顯差異。接種量大于 1.1%時，茶湯開始出現(xiàn)渾濁。接種量小于1.1%時，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶的澀味較重；接種量大于1.2%時，菌味越來越明顯，對滋味產(chǎn)生明顯影響，與香氣結果一致。綜合考慮，接種量為1.2%時，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶的感官品質最好。

表1 不同接種量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質Table 1 Sensory quality of tea fermented by different inoculation amounts of aroma-producing strains from litchi

2.1.2 接種量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的影響 對不同接種量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分進行測定，結果見圖1。由圖1可知，不同接種量對產(chǎn)香菌發(fā)酵茶中水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量具有顯著性影響(P<0.05)。隨著接種量增加，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶中水浸出物和游離氨基酸含量呈現(xiàn)下降-上升-下降的變化趨勢，但在1.2%時二者含量均達到最高值。隨著接種量增加，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶中可溶性糖含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，而茶多酚含量呈現(xiàn)上下波動。綜合分析，接種量在1.2%～1.3%時，利于荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的形成。

不同小寫字母表示0.05水平的顯著性差異，下圖同

2.2 茶坯含水量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響

2.2.1 茶坯含水量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質的影響 對不同茶坯含水量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶進行感官審評，結果見表2。由表2可知，隨著含水量增加，發(fā)酵茶品質整體上呈現(xiàn)變好的趨勢。茶坯含水率為45%時茶葉湯色出現(xiàn)顯著變化，色澤由淺變深，可能是由于物質轉化程度加劇。最終根據(jù)審評結果以及黑茶實際生產(chǎn)發(fā)酵含水量的需要綜合考慮，選擇45%為最佳茶坯含 水量。

2.2.2 茶坯含水量對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的影響 對不同茶坯含水量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分進行測定，結果見圖2。由圖2可知，不同茶坯含水量對產(chǎn)香菌發(fā)酵茶樣水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量均有顯著性影響(P<0.05)。隨著茶坯含水量增加，水浸出物、游離氨基酸和可溶性糖含量呈現(xiàn)上下波動的無規(guī)律變化，其中茶坯含水量為45%時，三者含量都處于較高水平；茶多酚含量呈現(xiàn)先減后增的趨勢。綜合分析，茶坯含水量為45%時，利于茶葉理化品質的形成。

2.3 發(fā)酵溫度對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響

2.3.1 發(fā)酵溫度對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質的影響 對不同溫度下發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶進行感官審評，結果見表3。由表3可知，25～32 ℃條件下，茶樣香氣較好，尤其25 ℃下茶樣略帶花草香，發(fā)酵溫度過高或者過低都會出現(xiàn)酸味，不利于茶葉品質的形成。溫度小于28 ℃時，茶葉草腥味重，溫度大于32 ℃時，茶湯滋味明顯改善，說明在低溫條件下，產(chǎn)香菌產(chǎn)生的有益茶葉滋味品質形成的物質較少?？傮w來看，32 ℃條件下發(fā)酵效果最佳。

表2 不同茶坯含水量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶感官品質Table 2 Sensory quality of tea fermented by aroma from litchi with different water contents in tea material

圖2 不同茶坯含水量發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分Fig.2 Components of tea fermented by aroma-producing litchi with different water contents in tea material

表3 不同溫度發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶感官品質Table 3 Sensory quality of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation temperatures

2.3.2 發(fā)酵溫度對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的影響 對不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分進行測定，結果見圖3。由圖3可知，不同發(fā)酵溫度發(fā)酵茶樣的水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖及茶多酚含量均有顯著差異(P<0.05)。隨著發(fā)酵溫度增加，產(chǎn)香菌發(fā)酵茶中水浸出物和可溶性糖含量呈現(xiàn)上下波動的無規(guī)律變化，但發(fā)酵溫度在32 ℃和45 ℃時兩者含量都較高。同時，32 ℃下發(fā)酵茶游離氨基酸含量顯著(P< 0.05)高于其他溫度下發(fā)酵茶，且其他溫度下發(fā)酵茶中游離氨基酸含量之間沒有顯著性差異(P> 0.05)。綜合分析，最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

圖3 不同溫度發(fā)酵的荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化成分Fig.3 Chemical components of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation temperatures

2.4 發(fā)酵時間對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響

2.4.1 發(fā)酵時間對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質的影響 對不同發(fā)酵時長下的荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶進行感官審評，結果見表4。由表4可知，隨著發(fā)酵時間增加，茶葉菌味越來越明顯，而青氣減少。但發(fā)酵時間大于20 d后茶葉香氣變?yōu)閻炍?，可能是發(fā)酵時間過長，發(fā)酵罐通氣性差導致。發(fā)酵 10～20 d的茶樣滋味較醇和，其中發(fā)酵20 d時茶樣具有菌味，與香氣審評結果一致。綜合考慮，最佳發(fā)酵時間為20 d，發(fā)酵時間過短或過長都不利于茶葉滋味的形成。

表4 不同發(fā)酵時間的荔枝產(chǎn)香菌茶感官品質Table 4 Sensory quality of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation time

2.4.2 發(fā)酵時間對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的影響 對不同發(fā)酵時長的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分進行測定，結果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵時間對發(fā)酵茶水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量具有顯著性影響(P<0.05)，且隨著發(fā)酵時間延長，4種成分整體上都呈現(xiàn)降低趨勢，其中可溶性糖和茶多酚含量在發(fā)酵20 d時有較大增幅。結合審評結果，發(fā)酵20 d時茶樣香氣和滋味中都出現(xiàn)菌味的現(xiàn)象，因此推測發(fā)酵20 d時，菌株可能利用不溶性的物質生成游離氨基酸和茶多酚。綜合考慮，發(fā)酵最佳時間為20 d。

3 討 論

3.1 不同條件對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶感官品質的影響

本試驗主要探究了接種量、茶坯含水量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對于荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶品質的影響。由黑茶發(fā)酵機理可知，不同外界條件會對黑茶發(fā)酵過程產(chǎn)生重要影響，其品質特征會發(fā)生顯著變化。由4組單因素試驗結果可以看出，經(jīng)工藝優(yōu)化后的發(fā)酵茶其感官品質明顯優(yōu)于對照組，特別是發(fā)酵茶的香氣品質。當產(chǎn)香菌接種量過多或茶葉發(fā)酵時間過長時，發(fā)酵茶會逐漸產(chǎn)生酸味，并且隨著程度的加深酸味越明顯，這可能是由于微生物的過量生長導致茶葉發(fā)酵程度過重，產(chǎn)生過多的酸性物質[12]。在適宜的溫度條件和茶坯含水量條件下，發(fā)酵茶香型向酯香型轉變[13]，表明此時發(fā)酵茶中具有酯類物質的產(chǎn)生，這可能是由于外界環(huán)境的誘導，使得微生物的代謝過程發(fā)生變化，從而產(chǎn)生有利于發(fā)酵茶品質的物質。

3.2 不同條件對荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化品質的影響

在不同條件下，荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶理化成分發(fā)生復雜變化。本試驗中主要測定了發(fā)酵茶中水浸出物、游離氨基酸、可溶性糖和茶多酚含量。微生物在生長過程中需要利用一定的氮源和碳源物質來維持自身生長[14-15]，因此茶葉中可溶性糖和游離氨基酸被微生物優(yōu)先消耗[16]。微生物在生長的同時會分泌多種酶類，如纖維素酶、果膠酶、脂肪酶和單寧酶等[17-20]，在酶的作用下，茶葉中的不溶性大分子物質會轉化為可溶性物質，增加可溶性物質的含量，同樣生成多種促進茶葉品質形成的物質，因此發(fā)酵茶的水浸出物、游離氨基酸和可溶性糖含量可能由于微生物生長消耗與酶水解不溶性物質而呈現(xiàn)動態(tài)變化。茶多酚是一類極易被氧化的物質，除了在酶的作用下分解外，發(fā)酵過程自然氧化也會導致其含量的降低[21]，因此茶多酚含量在發(fā)酵過程中顯著降低。目前對茶葉發(fā)酵代謝組的研究層面相對較淺，并沒有很好地解釋發(fā)酵過程中物質的詳細變化過程。

圖4 不同發(fā)酵時間的荔枝產(chǎn)香菌茶理化成分Fig.4 Chemical components of tea fermented by aroma-producing litchi with different fermentation time

3.3 荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶的推廣價值

縱觀安化黑茶的發(fā)展歷史，其發(fā)展推動力逐漸由政府或市場主導轉變?yōu)槭袌龊图夹g創(chuàng)新共同主導，技術創(chuàng)新已成為安化黑茶發(fā)展的重要戰(zhàn)略之一[22]。微生物在黑茶品質形成中占有的重要地位已得到公認，對普洱茶、茯磚茶、六堡茶和四川黑茶渥堆發(fā)酵過程中微生物的研究正持續(xù)進行中，特別是普洱茶中微生物的研究層面和研究手段已相對較多[23-27]。筆者用于黑茶發(fā)酵的微生物，已經(jīng)不能僅僅局限于從渥堆茶葉中分離獲得，其他來源的優(yōu)質菌株的利用同樣具有良好的發(fā)展前景[28]。荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵茶的運用不僅提高茶葉原料的品質，而且對黑茶清潔化生產(chǎn)和開發(fā)黑茶新產(chǎn)品具有重要意義。因此，荔枝產(chǎn)香菌發(fā)酵榮具有一定的推廣價值。