付 博，王家哲，任 平，李英梅，張 鋒

(1. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所 陜西省植物線蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710043；2. 陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710600)

2015年1月，我國(guó)農(nóng)業(yè)部提出了馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略，力爭(zhēng)通過擴(kuò)大種植面積、提效增產(chǎn)，使馬鈴薯成為我國(guó)的第四大主糧作物[1,2]。陜西北部(包括榆林和延安)地處黃土高原，馬鈴薯是當(dāng)?shù)刂饕Z食作物和經(jīng)濟(jì)作物，是近年來當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收和精準(zhǔn)扶貧的首選優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，僅2017年陜北地區(qū)的馬鈴薯種植面積就達(dá)到了23.1萬hm2，占全省馬鈴薯總面積的60%[3]。馬鈴薯腐爛線蟲(Ditylenchus destructor)是危害馬鈴薯塊莖的重要檢疫性有害生物，一般可造成馬鈴薯減產(chǎn)20%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%，嚴(yán)重影響了馬鈴薯的產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4～6]。該病害在其他國(guó)家和地區(qū)也均有發(fā)生，并可在甘薯上引起嚴(yán)重病害，一般引起甘薯田塊減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重時(shí)絕產(chǎn)絕收[7]。目前，我國(guó)對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲危害的相關(guān)研究報(bào)道較少，對(duì)榆林地區(qū)馬鈴薯線蟲病害的研究尚未見報(bào)道。

馬鈴薯腐爛莖線蟲的鑒定方法，主要包括形態(tài)學(xué)分析(鏡檢形態(tài)觀察和數(shù)據(jù)測(cè)量)和分子生物學(xué)檢測(cè)(對(duì)rRNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)分析)[8]。由于線蟲形態(tài)具有復(fù)雜和重疊交錯(cuò)的特點(diǎn)，在種水平和生物型上很難區(qū)分，因此分子診斷逐漸成為植物線蟲研究的新途徑[9, 10]。近年來，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道顯示馬鈴薯腐爛莖線蟲存在種群分化現(xiàn)象，Subbotin等人對(duì)全球范圍內(nèi)已報(bào)道的78個(gè)馬鈴薯腐爛莖線蟲的rRNA-ITS區(qū)序列和28S rRNA-D2/D3區(qū)序列進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示基因序列和長(zhǎng)度在不同群體間存在明顯差異，并將馬鈴薯腐爛莖線蟲劃分為7個(gè)生物型，主要為A型和B-G型兩個(gè)分支，除G型外，其他6種生物型在中國(guó)都有分布，表明馬鈴薯腐爛莖線蟲在我國(guó)的分布具有遺傳多樣性豐富的特征[11]。王金成等通過對(duì)馬鈴薯腐爛莖線蟲7個(gè)地理群體的ITS序列分析，證明了我國(guó)的馬鈴薯腐爛莖線蟲種群主要分為A型和B型2個(gè)分支[12]。

隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展擴(kuò)大，線蟲為害風(fēng)險(xiǎn)也日漸增加，明確馬鈴薯線蟲病的發(fā)生情況和線蟲種群類型，對(duì)有效防控該病害具有重要意義。筆者研究采用特異性分子生物學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)陜西榆林地區(qū)的馬鈴薯腐爛莖線蟲進(jìn)行種類鑒定，明確該地區(qū)線蟲病害的種類并分析群體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為馬鈴薯腐爛莖線蟲病的快速診斷和及時(shí)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 馬鈴薯采集自陜西榆林地區(qū)8個(gè)不同采樣點(diǎn)，選取外表有腐爛癥狀，表皮皺縮、龜裂的薯塊并置于4 ℃冰箱保存。將病薯切成小塊浸泡于適量水中，兩層面巾紙過濾12 h后收集病原線蟲[13]。馬鈴薯的采集時(shí)間、地點(diǎn)見表1。

1.1.2 主要試劑及儀器 Taq PCR Master Mix(Cat. No.：B639295)、DNA marker 2000 (Cat. No.：B600335)購(gòu)自上海生工。PCR儀(eppendorf Mastercycler gradient)、冷凍離心機(jī)(Sigma 1-14K)、電泳儀(Baygene BG-Power 600)、紫外分析儀(ChampGel 5000)、顯微鏡(奧林巴斯BX-41)等。

1.1.3 引物序列 馬鈴薯腐爛莖線蟲PCR擴(kuò)增的通用引物和特異性引物均由西安擎科澤生物技術(shù)有限公司合成，序列見表2。

表1 馬鈴薯采集信息

表2 PCR擴(kuò)增引物

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯腐爛莖線蟲DNA提取 取1滴線蟲溶液至潔凈的凹玻片，體視顯微鏡下并挑取待測(cè)線蟲(每個(gè)檢測(cè)樣品100頭蟲)，放入至含有14 μL 10×Extaq Buffer，蛋白酶K(2 mg·mL-1)6 μL，ddH2O 20 μL的PCR管中，于-80 ℃冰箱冷凍保藏2 h，玻璃棒研磨2次以上。PCR運(yùn)行程序：65 ℃ 90 min，85 ℃10 min，13 000 r·min-1離心1 min取上清即為馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA[15]。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定 反應(yīng)體系 Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR擴(kuò)增條件： 95 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存[15]。取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，設(shè)置120 v 20 min，在凝膠成像儀中觀察并照相。

1.2.3 測(cè)序及序列分析 將PCR產(chǎn)物送西安擎科澤生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的8個(gè)種群序列與GenBank中下載的7個(gè)國(guó)內(nèi)外種群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列進(jìn)行ClustalX比對(duì)分析，采用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 通用引物擴(kuò)增馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS序列的結(jié)果

分別以陜西榆林8個(gè)地區(qū)馬鈴薯腐爛莖線蟲的總DNA為模板，采用通用引物rDAN1/ rDAN2擴(kuò)增rDNA-ITS序列，結(jié)果顯示8個(gè)地區(qū)種群的樣本均擴(kuò)增出1100 bp的條帶，無940 bp的條帶(圖1)，判斷這8個(gè)地區(qū)的馬鈴薯線蟲病害是由B型馬鈴薯腐爛莖線蟲引起[15]。

2.2 特異性引物鑒定馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型

采用特異性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2分別進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示擴(kuò)增出485 bp條帶，無252 bp條帶(圖2)。采用特異性引物對(duì)陜西8個(gè)地區(qū)的馬鈴薯腐爛莖線蟲進(jìn)行分型鑒定，結(jié)果均為B型，與上述通用引物PCR擴(kuò)增鑒定的結(jié)果一致。

2.3 馬鈴薯莖線蟲rDNA-ITS序列分析

特異性引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果顯示，序列1～8與馬鈴薯腐爛莖線蟲的同源性均達(dá)到99%以上。將榆林地區(qū)8個(gè)種群的特異性引物擴(kuò)增序列與GenBank中7個(gè)國(guó)內(nèi)外馬鈴薯腐爛莖線蟲種群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列進(jìn)行ClustalX比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，在親緣關(guān)系上所有的序列聚為3個(gè)分支，獲得的榆林地區(qū)8個(gè)種群中，1、2、3、4、5、8和EF062575、AM232227群體聚為一個(gè)分支，6和KC923223、EF062574群體聚為一個(gè)分支，7和EF062572、AY987007、FJ911551群體聚為一個(gè)分支，榆林地區(qū)8個(gè)地理種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較高的親緣關(guān)系。

3 討論

自2012年以來筆者研究團(tuán)隊(duì)在陜西省植?？傉镜拇罅χС窒拢瑥年兾魇∮芰值貐^(qū)的馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)疑似馬鈴薯腐爛莖線蟲病害，并連續(xù)多年對(duì)陜西榆林、延安等地區(qū)的馬鈴薯檢疫性病蟲害進(jìn)行了田間調(diào)查，完成了馬鈴薯腐爛莖線蟲的人工培育、形態(tài)觀察和分子鑒定、生態(tài)適應(yīng)性分析等一系列工作[16]。近年來，陜西榆林地區(qū)的馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但是線蟲為害風(fēng)險(xiǎn)也日漸增加，為進(jìn)一步明確線蟲種類，實(shí)現(xiàn)快速診斷和有效防控，筆者研究采用特異性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2進(jìn)行線蟲分子鑒定。研究結(jié)果表明，陜西省榆林8個(gè)地區(qū)的馬鈴薯線蟲病害的病原線蟲是馬鈴薯腐爛莖線蟲，其生物型為B型。rDNA-ITS序列進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，這8個(gè)地區(qū)的馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較高的親緣關(guān)系。

王金成等通過DNA-ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育研究證明了我國(guó)腐爛莖線蟲是1個(gè)復(fù)合種群體，明確了河北、江蘇、山西、山東、安徽5個(gè)省份的甘薯上的馬鈴薯腐爛莖線蟲包含A型和B型2種[12]。李惠霞等研究了甘肅省定西市馬鈴薯線蟲病的病原種群分類地位，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及rDNA-ITS序列分析確定該病原線蟲為馬鈴薯腐爛莖線蟲，并發(fā)現(xiàn)其存在B型和C型2個(gè)不同的生物型[2]。目前，我國(guó)馬鈴薯腐爛莖線蟲存在較為嚴(yán)重的群體分化現(xiàn)象，包括了A～F 6種不同類型[11, 17]，筆者研究中鑒定的陜西榆林地區(qū)為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)不同地區(qū)腐爛莖線蟲群體的差異明顯，說明其正處于快速進(jìn)化過程，并且不同地理來源的腐爛莖線蟲在抗藥性、致病力、蟲體大小等方面也存在差異[18～20]。

筆者研究明確了陜西榆林馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型，證明了特異性引物適用于快速鑒定腐爛莖線蟲A型和B型群體，為腐爛莖線蟲種群的分類學(xué)、群體遺傳學(xué)研究， 以及有針對(duì)性開展病害防治提供理論指導(dǎo)。