倪浩亮 韓越俊 金晰函 杜金林

[摘要] 目的 探討miR-451a和MMP-2蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況及兩者對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫印跡分別檢測(cè)結(jié)直腸癌組織與癌旁組織（來自2018年金華市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本），多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中miR-451a的表達(dá)和MMP-2蛋白的表達(dá);在HCT116細(xì)胞系中過表達(dá)miR-451a（miR-451a-mimic）檢測(cè)MMP-2蛋白表達(dá);miR-451a-mimic或沉默MMP-2表達(dá)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果 在結(jié)直腸癌組織中miR-451a表達(dá)明顯下降，MMP-2蛋白的表達(dá)顯著升高，這種結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)在各個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，以HCT116細(xì)胞株最為明顯;在HCT116細(xì)胞系中miR-451a-mimic顯著減少M(fèi)MP-2蛋白表達(dá)量，miR-451a-mimic或沉默MMP-2均會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。 結(jié)論 miR-451a在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯降低，其本身可能通過抑制MMP-2蛋白的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

[關(guān)鍵詞] miR-451a;MMP-2;結(jié)直腸癌;增殖

[中圖分類號(hào)] R735.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）09-0015-05

[Abstract] Objective To investigate the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in colorectal cancer tissues and their effects on tumor cell proliferation. Methods Reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting were used to detect the expression of miR-451a and MMP-2 proteins in multiple tumor cell lines in colorectal cancer tissues and paracancerous tissues （from the specimens surgically resected by Jinhua Central Hospital in 2018）， respectively. The expression of MMP-2 protein was detected by over-expression of miR-451a（miR-451a-mimic） in HCT116 cell lines; cell proliferation was detected by miR-451a-mimic or by silencing MMP-2 expression. Results The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues significantly decreased， while the expression of MMP-2 protein significantly increased; this result was found in all colorectal cancer cell lines simultaneously， with the HCT116 cell line being the most obvious; miR-451a-mimic significantly reduced the expression of MMP-2 protein in HCT116 cell lines， and miR-451a-mimic or silencing MMP-2 inhibited the proliferation of tumor cells. Conclusion The expression of miR-451a in colorectal cancer tissues is significantly reduced， which itself may inhibit the proliferation of tumor cells by inhibiting the expression of MMP-2 protein.

[Key words] miR-451a; MMP-2; Colorectal cancer; Proliferation

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上第三大最常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。全世界約有50%的CRC患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2-3]。盡管CRC的診斷和治療有所改善，但每年有超過60萬例患者死于CRC。近年來由于飲食結(jié)構(gòu)和生活水平的改變，該病在我國(guó)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[4]。miR-451最早是由Altuvia等[5]在2005年從人腦垂體RNA中提取并命名，位于17q11.2染色體上。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metal proteinase 2，MMP-2）參與腫瘤基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，與腫瘤關(guān)系密切，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。文獻(xiàn)報(bào)道顯示miR-451能夠抑制乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和非小細(xì)胞肺癌中的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲和遷移[6-8]，但其在結(jié)直腸癌中表達(dá)及對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲機(jī)制的研究不夠充分。本研究將采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）分析結(jié)腸癌組織和癌旁組織中miR-451的表達(dá)差異，免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌組織中MMP-2的蛋白表達(dá)情況，并探討兩者與結(jié)腸癌的相關(guān)性，以及共同參與細(xì)胞增殖抑制的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

12例結(jié)腸癌組織和癌旁組織取自2018年金華市中心醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受過放化療，術(shù)后病理診斷證實(shí)均為結(jié)腸癌Ⅱ期中分化腺癌。標(biāo)本：男6例，女6例，本研究獲得金華市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，組織標(biāo)本的收集均征得患者本人的知情同意。人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116、SW480購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心，人結(jié)腸正常黏膜上皮細(xì)胞株NCM60本實(shí)驗(yàn)室保存;過表達(dá)pcDNA-miR451a（pcDNA-miR-451a-mimic）、pcDNA-NC、psilencer-MMP-2pcDNA-MMP-2及對(duì)照質(zhì)粒psilencer-Scr由上海吉?jiǎng)P生物公司構(gòu)建，miR-451a RT PCR引物購(gòu)自北京擎科有限責(zé)任公司;Lipofectamine TM 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;MMP-2抗體購(gòu)自CST公司;GAPDH抗體、辣根酶過氧化物標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Realtime-PCR檢測(cè)組織及各細(xì)胞系中miR-451a的表達(dá)? 采用Trizol法提取癌組織、癌旁組織以及各細(xì)胞系的總RNA，首先加一定量Trizol，然后以5：1的比例加入氯仿，充分混勻，靜置5 min，然后3000 rpm 4℃離心10 min，取上清加入異丙醇（根據(jù)Trizol量按2：1加）混勻靜置10 min，3000 rpm 4℃離心5 min，去上清，加入75%乙醇洗滌，7500 r/min 4℃離心5 min，去上清，加入DEPC水溶解沉淀。根據(jù)OD260/OD280比值判斷提取RNA的純度，根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求以5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3'引 物合成cDNA。按VazymemiRNA Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明，配制PCR反應(yīng)體系，在定量PCR儀器上進(jìn)行Realtime-PCR，最后用2-△△CT公式計(jì)算miR-451a表達(dá)量，并且采用內(nèi)參基因u6作為內(nèi)對(duì)照。

1.2.2 Western blot檢測(cè)組織和各細(xì)胞系中MMP-2蛋白水平表達(dá)情況? 取100 mg組織置入EP管中，并加入1 mL RIPA蛋白裂解液（已經(jīng)加入蛋白酶抑制劑）。用電動(dòng)勻漿器置于冰上勻漿，至肉眼不見塊狀組織為止，冰上充分裂解1 h，收集液體;取適量RIPA蛋白裂解液（加入蛋白酶抑制劑）加入6孔板中，機(jī)械破碎細(xì)胞，冰上充分裂解30 min提取液體。收集好的液體在3000 rpm 4℃條件下離心15 min，去沉淀，BCA法測(cè)濃度后置入-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ∠♂尯玫臉悠愤M(jìn)行SDS-PAGE電泳（分離膠12%，濃縮膠5%），轉(zhuǎn)膜，4℃封閉過夜。一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌后，再與HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，ECL顯色，照相。

1.2.3細(xì)胞系中miR-451a-mimic檢測(cè)MMP-2表達(dá)情況? 細(xì)胞均用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DEME培養(yǎng)基在5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。消化細(xì)胞收集到12孔板上，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR 451a、pcDNA-NC轉(zhuǎn)染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，免疫印跡法檢測(cè)MMP-2的蛋白含量，每組重復(fù)3次。

1.2.4 miR-451a-mimic或沉默MMP-2或同時(shí)miR-451a-mimic和MMP-2之后MTT法檢測(cè)感染細(xì)胞的生存狀況? 消化適量細(xì)胞收集到96孔板上，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)孔，待24 h后分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a、psilencer-MMP-2、pcDNA-NC、psilencer-Scr以及同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-miR451a和pcDNA-MMP-2，在0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后在待測(cè)孔每孔加入適量MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液。每孔加入DMSO150 μL，避光震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。測(cè)定570 nm處檢測(cè)各孔吸光值（optical density，OD）。繪制對(duì)應(yīng)時(shí)間的生長(zhǎng)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，雙變量數(shù)據(jù)采用雙因素變量方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中miR-451a和MMP-2的表達(dá)水平

RT-PCR的結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中的miR-451a表達(dá)水平顯著下降，Western blot顯示MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高（圖1、表1），在三個(gè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，miR-451a表達(dá)水平均顯著下降，MMP-2蛋白表達(dá)量均顯著升高，因此為了更好的研究其中機(jī)制，選取三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系分別為HT29、SW480和HCT116來驗(yàn)證miR-451a和MMP-2在體外的表達(dá)。結(jié)果顯示在三種結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，miR-451a表達(dá)水平均下降，而MMP-2蛋白表達(dá)量均升高，尤其在HCT116細(xì)胞系中miR-451a表達(dá)水平下降最為明顯，而MMP-2蛋白表達(dá)量則升高最為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2、表2）。進(jìn)而我們選取HCT116細(xì)胞系來進(jìn)行體外機(jī)制的驗(yàn)證。

2.3結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-451a-mimic、沉默MMP-2對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

在轉(zhuǎn)染miR-451a-mimic質(zhì)粒、沉默MMP-2質(zhì)粒后，HCT116細(xì)胞在48 h后出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的明顯抑制作用，達(dá)到72 h時(shí)，抑制效果最為明顯。HCT116細(xì)胞系中miR-451a-mimic其48 h和72 h抑制率分別為18.25%和37.23%，沉默MMP2基因后，48 h和72 h抑制率分別為29.54%和43.42%（圖4、表3）。

3討論

miRNA以干擾mRNA翻譯的方式負(fù)向調(diào)控基因的表達(dá)，能夠與靶基因的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域特異性結(jié)合而導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。其中miR-451a被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。Bandres E等[9]研究顯示在胃癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，miR-451a-mimic可以有效降低巨噬細(xì)胞遷移抑制因子的mRNA和蛋白量，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展。除此之外，有文獻(xiàn)指出[10]AMP活化蛋白激酶也是miR-451a的潛在作用因子，miR-451a-mimic能夠抑制AMP活化蛋白激酶對(duì)雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1的激活作用，從而達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)的目的。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，能對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分進(jìn)行降解，這種作用是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要條件[11-13]。MMP-2具有明膠酶的特性，可以在腫瘤浸潤(rùn)時(shí)，分解細(xì)胞外基質(zhì)的通路，可以使細(xì)胞外基質(zhì)重新排列，加速腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移[14，15]。MMP-2的過度表達(dá)加強(qiáng)了惡性腫瘤的局部侵襲能力和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移能力，使病情進(jìn)一步的惡化[16，17]。有研究顯示在結(jié)直腸癌病變組織中MMP-2表達(dá)升高，明顯異于正常的結(jié)直腸組織[18]。

有研究顯示在胃癌細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)量受到miR-451a表達(dá)的影響，但在結(jié)直腸癌中尚未有足夠的研究揭示這兩者的關(guān)系[19，20]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中miR-451a-mimic后發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)量相應(yīng)的減少，證明MMP-2的表達(dá)確實(shí)受到miR-451a的影響，分別轉(zhuǎn)染miR-451a-mimic以及抑制MMP-2的表達(dá)均會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，將miR-451a-mimic和MMP-2同時(shí)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增殖沒有抑制，說明MMP-2蛋白恢復(fù)表達(dá)時(shí)，miR-451a-mimic并不能抑制癌細(xì)胞的增殖，可知miR-451a抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于MMP-2的表達(dá)。

總而言之，miR-451a和MMP-2在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中均分別扮演了關(guān)鍵角色，但其中MMP-2和miR-451a兩者之間的相互關(guān)系及共同對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響還未充分研究。本研究旨在探討miR-451a和MMP-2兩者在結(jié)直腸癌中共同發(fā)揮作用的聯(lián)系，以闡明miR-451a作為抑癌因子具體的功能機(jī)制，為腫瘤個(gè)體化治療提供幫助。本實(shí)驗(yàn)只能證實(shí)miR-451a表達(dá)可以抑制MMP-2表達(dá)，其中具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lancet T. Toward better control of colorectal cancer[J]. Lancet，2014，383（9927）：1437.

[2] Liu J，Li H，Sun L，et al. Epigenetic alternations of microRNAs and DNA methylation contribute to liver metastasis of colorectal cancer[J]. Dig Dis Sci，2019，64（6）：1523-1534.

[3] Zhang T，Guo J，Gu J，et al. Identifying the key genes and microRNAs in colorectal cancer liver metastasis by bioinformatics analysis and in vitro experiments[J]. Oncol Rep，2019，41（1）：279-291.

[4] Shen Y，Gong JM，Zhou LL，et al. MiR-451 as a new tumor marker for gastric cancer[J]. Oncotarget，2017，8（34）：56542-56545.

[5] Altuvia Y，Landgraf P，Lithwick G，et al. Clustering and conservation patterns of human microRNAs[J]. Nucleic Acids Res，2005，33（8）：2697-2706.

[6] Gits CM，van Kuijk PF，Jonkers MB，et al. MicroRNA expression profiles distinguish liposarcoma subtypes and implicate miR-145 and miR-451 as tumor suppressors[J].Int J Cancer，2014，135（2）：348-361.

[7] Tian Y，Nan Y，Han L，et al. MicroRNA miR-451 downregulates the PI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma[J]. Int J Oncol，2012，40（4）：1105-1112.

[8] Lopotová T，Zá■ková M，Klamová H，et al. MicroRNA-451 in chronic myeloid leukemia：miR-451-BCR-ABL regulatory loop？[J]. Leuk Res，2011，35（7）：974-977.

[9] Bandres E，Bitarte N，Arias F，et al. microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor produ-ction and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J]. Clin Cancer Res，2009，15（7）：2281-2290.

[10] Sun X，Lou L，Zhong K，et al. MicroRNA-451 regulates chemoresistance in renal cell carcinoma by targeting ATF-2 gene[J]. Exp Biol Med （Maywood），2017，242（12）：1299-1305.

[11] Li Z，Shan F，Ying X，et al. Laparoscopic versus open gastrectomy for elderly local advanced gastric cancer patients：Study protocol of a phase II randomized controll-ed trial[J]. BMC Cancer，2018，18（1）：1118.

[12] Agraval H，Ucs Y. MMP-2 and MMP-9 mediate cigarette smoke extract-induced epithelial-mesenchymal transition in airway epithelial cells via EGFR/Akt/GSK3β/β-catenin pathway：Amelioration by fisetin[J]. Chem Biol Interact，2019，314：108846.

[13] Santiago-Ruiz L，Buendía-Roldán I，Pérez-Rubio G，et al. MMP2 polymorphism affects plasma matrix metall-oproteinase（MMP）-2 levels，and correlates with the decline in lung function in hypersensitivity pneumonitis positive to autoantibodies patients[J]. Biomolecules，2019，9（10）：574.

[14] Lee KS，Shin S，Cho E，et al. nc886，A non-coding RNA，inhibits UVB-induced MMP-9 and COX-2 expression via the PKR pathway in human keratinocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun，2019，512（4）：647-652.

[15] Tsai MH，Wu CH，Lin WN，et al. Infection with staphylococcus aureus elicits COX-2/PGE2/IL-6/MMP-9-dependent aorta inflammation via the inhibition of intracellular ROS production[J]. Biomed Pharmacother，2018， 107：889-900.

[16] Shashni B，Nagasaki Y.Nitroxide radical-containing na-noparticles attenuate tumorigenic potential of triple negative breast cancer[J]. Biomaterials，2018，178：48-62.

[17] Xu H，Ren YJ，Liu K，et al. Correlations of serum VEGF and MMP-2 levels with CLM in CRC patients and effects of TACE on their expressions[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（11）：3394-3401.

[18] Ling L，Li Y，Li H，et al. MMP-2 and MMP-9 gene polymorphisms act as biological indicators for ulinastatin efficacy in patients with severe acute pancreatitis[J]. Me-dicine （Baltimore），2019，98（24）：e15831.

[19] Mashhadiabbas F，Neamatzadeh H，F(xiàn)oroughi E，et al. Association of MMP-2-753C>T and MMP-9-1562C>T polymorphisms with chronic/aggressive periodontitis risk：A systematic review and meta-analysis[J]. Iran J Public Health，2019，48（7）：1227-1238.

[20] Peyronnet B，Richard C，Bendavid C，et al. Urinary TIMP-2 and MMP-2 are significantly associated with poor bladder compliance in adult patients with spina bifida[J]. Neurourol Urodyn，2019，38（8）：2151-2158.

（收稿日期：2019-12-19）