董佳萍，顏飛翔，牛廣財(cái), *，陳龍，李思萱，任潔萍

1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163319）；2. 黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）

中國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)發(fā)布的《酵素產(chǎn)品分類導(dǎo)則》標(biāo)準(zhǔn)中，將酵素定義為以動(dòng)物、植物和食用菌等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素產(chǎn)品[1]。以一種或多種蔬菜、水果、中草藥等為原料，通過(guò)酵母菌、乳酸菌、醋酸菌、食用真菌等益生菌發(fā)酵工藝制備的較多。郭偉峰等[2]利用新鮮桑葚進(jìn)行試驗(yàn)，主要考察SOD酶活力，經(jīng)試驗(yàn)得出優(yōu)化后工藝條件為接種醋酸菌接種量10%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h，按照該條件發(fā)酵所得到的桑葚酵素飲料色澤鮮艷，酸甜適中，氣味濃厚，液體清澈無(wú)沉淀，有桑葚獨(dú)特的香味；彭寧等[3]主要采用獼猴桃為主要原料，添加少許紅糖，利用酵母菌和乳酸菌（4∶1）進(jìn)行接種發(fā)酵，優(yōu)化的獼猴桃酵素生產(chǎn)工藝為發(fā)酵時(shí)間5 d、發(fā)酵溫度30 ℃、菌種接種量4%，此時(shí)感官得分93分。劉維兵等[4]以葡萄與海棠果為主要原材料，得出最優(yōu)酵素發(fā)酵工藝為葡萄與海棠果質(zhì)量比5∶1、酵母菌接種量0.20%、初始pH 3.8、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h，該酵素具有一定抑菌性和抗氧化活性。大量研究表明，酵素具有抗疲勞、抗衰老、抑菌消炎、提高機(jī)體免疫力、保護(hù)肝臟、降血脂、促進(jìn)消化、抗氧化抗腫瘤、控制糖病、清除自由基、抗誘變突變等功能[5-8]。酵素制備工藝中的自然發(fā)酵法發(fā)酵周期較長(zhǎng)，而且不好控制，人工接種發(fā)酵法是酵素發(fā)酵中經(jīng)常采用的快速發(fā)酵方法。

北五味子藥用價(jià)值較高，是滋補(bǔ)性中藥，列入衛(wèi)計(jì)委公布的可用于保健食品的物品名單；大麥營(yíng)養(yǎng)成分豐富，發(fā)芽后不但保留其本身的各種營(yíng)養(yǎng)成分，而且還形成非常豐富的酶系。試驗(yàn)以北五味子和大麥芽為原料，以酵母菌為發(fā)酵劑，制備北五味子麥芽酵素，并對(duì)其SOD酶活性、總多酚含量以及體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，以期為北五味子麥芽酵素產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子、大麥芽（均為市售）；RV171葡萄酒活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；Pectinex Ultra Color果膠酶（諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司）；SOD酶活力檢測(cè)試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（ABTS法）（南京建成生物工程研究所）；福林酚試劑（國(guó)藥集團(tuán)）；無(wú)水碳酸鈉、維生素C、鄰苯三酚、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵等（均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

WS108手持式折光儀（河北潤(rùn)聯(lián)科技開(kāi)發(fā)有限公司）；HR7633打漿機(jī)（飛利浦家庭電器（珠海）有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；TD5Z低速平衡離心機(jī)（金壇市城西春蘭試驗(yàn)儀器廠）；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器廠）；EX324電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；DRP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；UV-1100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海凌析達(dá)儀器）。

1.3 工藝流程與操作要點(diǎn)

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 酶解

北五味子破碎后，添加Pectinex Ultra Color果膠酶進(jìn)行酶解，果膠酶添加量2.0 mL/kg，置于50 ℃水浴中酶解2 h，過(guò)濾后的濾汁可溶性固形物含量8%，備用。

1.3.2.2 麥芽的糖化

用磨粉機(jī)磨粉，過(guò)40目篩，浸入38～40 ℃溫水（粉水比1∶3）中浸泡40 min，升溫到52 ℃下浸泡30 min。隨后將溫度控制在63～65 ℃左右，保持60 min，調(diào)節(jié)溫度78 ℃，維持20 min滅酶，用100目篩網(wǎng)過(guò)濾，冷卻備用。

1.3.2.3 殺菌

采用超聲波殺菌方式對(duì)其原料進(jìn)行殺菌。將按一定比例配好的麥芽汁與北五味子酶解液，在100 W超聲波下處理15 min后，冷卻至室溫后接種。

1.3.2.4 活化與接種發(fā)酵

按照酵母粉與蒸餾水質(zhì)量比1∶10溶解高活性干酵母，放置在32 ℃恒溫水浴鍋中活化30 min，菌數(shù)3.2×106CFU/mL，備用。

在無(wú)菌室內(nèi)，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)比例，接入活化好的酵母菌液，在不同溫度和時(shí)間等條件下進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中和結(jié)束后分別測(cè)定該酵素產(chǎn)品的總多酚含量、SOD酶活及其抗氧化活性的變化。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 麥芽與北五味子比例的選擇

在酵母菌接種量0.6%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d條件下，考察麥芽汁與北五味子酶解液不同比例（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和1∶6）對(duì)酵素液中SOD酶活性和總多酚含量的影響，確定最適的麥芽汁與北五味子酶解液配比。

1.4.2 發(fā)酵時(shí)間的確定

選擇麥芽汁與北五味子酶解液比例1∶5，原料進(jìn)行處理后，酵母菌接種量0.6%，在28 ℃下發(fā)酵，分別在1～5 d時(shí)測(cè)定其總多酚和SOD酶活力，確定酵母菌的最適發(fā)酵時(shí)間。

1.4.3 發(fā)酵溫度的確定

選擇麥芽汁與北五味子酶解液比例1∶5，原料進(jìn)行處理后，酵母菌接種量0.6%，分別在22，25，28，31和34 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵3 d，測(cè)定其總多酚和SOD酶活力，確定酵母菌最適發(fā)酵溫度。

1.4.4 接種量的確定

選擇麥芽汁與北五味子酶解液比例1∶5，原料進(jìn)行處理后，發(fā)酵溫度設(shè)為28 ℃，酵母菌接種量分別為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1.0%，發(fā)酵3 d，測(cè)定其總多酚和SOD酶活力，確定酵母菌最適接種量。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以總多酚含量和SOD酶活力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(33)正交表來(lái)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以確定其最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 總多酚含量測(cè)定

采用福林酚法進(jìn)行測(cè)定[9]。稱取1 mL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品稀釋后，加入1 mL福林酚試劑及3 mL 20% Na2CO3，搖勻，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總多酚的含量?？偠喾訕?biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.179 2x+0.088 7，R2=0.998 6。

1.6.2 SOD酶活力的測(cè)定

將酵素液以3 800 r/min離心10 min后，按照SOD酶試劑盒說(shuō)明書具體標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行酶活力的測(cè)定。

1.6.3 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

按照試劑盒中說(shuō)明書所標(biāo)注的方法進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-1.121 4x+1.126 2（R2=0.995 7）計(jì)算出清除能力，其中，y代表其抗氧化能力，x代表吸光度。

1.6.4 羥自由基清除能力的測(cè)定

取0.1 mL樣品，加入2 mL 6 mmoL/L的過(guò)氧化氫溶液以及FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmoL/L的水楊酸溶液，搖勻，放置37 ℃恒溫水浴中1 h，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度A1。以去離子水為參比溶液，測(cè)定吸光度A0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)定吸光度A2。按式（1）計(jì)算羥自由基清除能力[10]。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣液吸光度；A2為樣液在體系中吸光度。

1.6.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將樣品溶液稀釋后，在試管中加入2 mL DPPH乙醇溶液及2 mL稀釋后溶液?；旌暇鶆蚝笤?5 ℃條件下，避光放置30 min，于517 nm波長(zhǎng)下用無(wú)水乙醇調(diào)零，測(cè)定其吸光度A1。空白對(duì)照以無(wú)水乙醇代替樣液，測(cè)定吸光度A0，以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光度A2[11]。按式（2）計(jì)算。

式中：A0為空白對(duì)照液吸光度；A1為樣品測(cè)定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽汁與北五味子酶解液比例的確定

由圖1可以看出，SOD酶活力隨著麥芽汁與北五味子酶解液比例增加至1∶5時(shí)，SOD酶活力最高可達(dá)3 117.13 U/mL，隨著北五味子含量提高，SOD酶活力開(kāi)始下降至最低為2 006.42 U/mL；從總多酚含量來(lái)看，同樣在麥芽汁與北五味子酶解液1∶5時(shí)，其含量達(dá)到最高134.85 mg/mL。綜合SOD酶活力與總多酚這2個(gè)指標(biāo)，選擇最適原料配比為麥芽汁與北五味子酶解液比例1∶5。

圖1 不同麥芽汁與北五味子酶解液比例對(duì)酵素中SOD酶活力和總多酚含量的影響

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)北五味子麥芽酵素的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液中總多酚含量逐漸增加，發(fā)酵第3天，總多酚含量達(dá)到最高，為130.77 mg/mL。發(fā)酵初始階段，SOD酶活力呈上升趨勢(shì)，第2天達(dá)到最高值為3 117.13 U/mL，隨后呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)榻湍妇臄?shù)量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，致使發(fā)酵液中氧氣含量減少，從而導(dǎo)致酵母菌無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇速率增加[12]。發(fā)酵第5天時(shí)，SOD酶活力和總多酚含量都降低。綜合來(lái)看，確定酵母菌發(fā)酵北五味子大麥芽酵素的最適發(fā)酵時(shí)間為3 d，此時(shí)，總多酚含量為130.77 mg/mL，SOD酶活力為3 108.52 U/mL。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD酶活力和總多酚含量的影響

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)北五味子麥芽酵素的影響

由圖3可知，發(fā)酵溫度逐漸升高時(shí)，發(fā)酵液中SOD酶活力也呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵溫度28 ℃時(shí)SOD酶活力達(dá)到最高，可達(dá)3 270.37 U/mL。發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時(shí)，SOD酶活力開(kāi)始下降，到34 ℃時(shí)SOD酶活力最低。發(fā)酵溫度升高至28 ℃時(shí)，總多酚含量增加至最高值，為138.19 mg/mL。發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時(shí)，總多酚含量開(kāi)始減少。綜合2個(gè)指標(biāo)，確定酵母菌發(fā)酵北五味子大麥芽酵素的最佳發(fā)酵溫度為28 ℃，此時(shí)總多酚含量為138.19 mg/mL，SOD酶活力為3 270.37 U/mL。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)SOD酶活力和總多酚含量的影響

2.4 接種量對(duì)北五味子麥芽酵素的影響

由圖4可知，酵母菌接種量由0.2%升高到0.8%時(shí)，總多酚含量逐漸增加并達(dá)到最大值，為140.03 mg/mL。隨著接種量增加，SOD酶活力呈緩慢上升趨勢(shì)；接種量0.8%時(shí)，SOD酶活力達(dá)到最高，為3 549.79 U/mL。接種量大于0.8%時(shí)，SOD酶活力和總多酚含量開(kāi)始下降。因此，北五味子大麥芽酵素最適酵母菌接種量為0.8%，此時(shí)SOD酶活力為3 549.79 U/mL，總多酚含量為140.03 mg/mL。

2.5 北五味子大麥芽酵素的工藝條件優(yōu)化

由表2可知，酵母菌發(fā)酵對(duì)北五味子大麥芽酵素SOD酶活力影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B，發(fā)酵溫度對(duì)SOD酶活力的影響最大，其次為接種量，發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD酶活力的影響最??；由K值可知，以SOD酶活力為指標(biāo)時(shí)的最優(yōu)組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度28 ℃，接種量0.8%，發(fā)酵時(shí)間3 d。對(duì)北五味子大麥芽酵素總多酚含量影響的主次順序?yàn)锳＞C＞B，發(fā)酵溫度對(duì)總多酚含量影響最大，其次為發(fā)酵時(shí)間，接種量對(duì)總多酚含量的影響最??；由K’值可知，以總多酚為指標(biāo)的最優(yōu)組合為A2B2C3，即發(fā)酵溫度28 ℃，接種量0.8%，發(fā)酵時(shí)間3 d。因此，酵母菌發(fā)酵北五味子大麥芽酵素的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度28 ℃，接種量0.8%，發(fā)酵時(shí)間為3 d。在此條件下，酵素產(chǎn)品的SOD酶活力為3 549.79 U/mL，總多酚含量為140.03 mg/mL。

圖4 接種量對(duì)SOD酶活力和總多酚含量的影響

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.6 北五味子麥芽酵素抗氧化活性的測(cè)定

由表3可以看出，發(fā)酵前后DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均略有下降，但是，羥自由基清除率有較明顯上升，由原來(lái)的90.59%上升到98.09%，高于4 mg/mL維生素C對(duì)羥自由基清除率，說(shuō)明該酵素對(duì)羥自由基有較好的清除效果。這可能是由于酵母菌的代謝產(chǎn)物增加導(dǎo)致多酚升高的緣故。黃雨洋等[13]研究結(jié)果表明，乙醇添加量在適合范圍內(nèi)，傳質(zhì)阻力小，多酚溶解性好，會(huì)使多酚得率和對(duì)羥自由基清除率增加。

表3 發(fā)酵前后清除自由基能力的變化

3 結(jié)論

酵母菌發(fā)酵制備北五味子麥芽酵素的最優(yōu)工藝條件為：大麥芽汁與北五味子酶解液配比1∶5、發(fā)酵溫度28 ℃、接種量0.8%、發(fā)酵時(shí)間3 d。在該條件下，SOD酶活力達(dá)到3 549.79 U/mL，總多酚含量達(dá)到140.03 mg/mL。該酵素的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS+自由基清除率較高，說(shuō)明通過(guò)酵母菌發(fā)酵，可以制備總多酚含量與SOD酶活力較高且具有較好抗氧化活性的北五味子大麥芽酵素產(chǎn)品。