林熠斌, 楊玉瑞, 黃榮雪, 趙玉瑩, 何陳鈴, 魏曉辰, 曾任森, 宋圓圓,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福州 350002 2 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002 3 福建農(nóng)林大學(xué)作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所, 福州 350002

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是土壤微生物群落的重要組成分,能與維管束植物共生形成菌根[1]。菌根不僅能夠提高植物對(duì)P、N、Zn、Fe、Cu、Mn和Ca等礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收[2- 4],還能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱、鹽漬、重金屬、冷、熱和水淹等各種逆境脅迫的耐受能力[5- 8]。

隨著對(duì)菌根功能研究的深入,越來(lái)越多的研究表明菌根共生可以增強(qiáng)寄主植物對(duì)病原物的抗性,且以拮抗病原真菌的研究居多。周寶利等[9]研究發(fā)現(xiàn)AMF能夠通過(guò)提高茄子根系活力,過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性來(lái)降低茄子黃萎病(Verticilliumdahlia, Kleb)的危害。Mustafa等[10-11]報(bào)道了接種摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和異形根孢囊霉(Rhizophagusirregularis)的小麥通過(guò)抑制分生孢子的數(shù)量極大地增強(qiáng)了對(duì)小麥白粉病(Blumeriagraminisf. sp.tritici)的抗性。此外,還有少量關(guān)于AMF與植物病毒病和細(xì)菌病互作的研究。例如,Maffei等[12]研究報(bào)道接種摩西斗管囊霉能夠減輕番茄對(duì)黃葉卷曲撒丁島病毒(yellow leaf curl Sardinia virus)的感染,菌根番茄植株表現(xiàn)出輕微的癥狀和較低濃度的病毒DNA；Mora-Romero等[13]將核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)和野菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.)接種到大豆和番茄葉片上,發(fā)現(xiàn)預(yù)先接種AMF的植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病性,同時(shí)還通過(guò)嫁接實(shí)驗(yàn)表明砧木菌根誘導(dǎo)的抗性信號(hào)也能夠誘導(dǎo)非菌根接穗的抗性反應(yīng)。顯然,與菌根真菌共生能夠誘導(dǎo)植物對(duì)病原菌的抗性非常普遍。這種抗性可能是由一種或幾種機(jī)制共同調(diào)節(jié)來(lái)起作用[14],包括改善寄主營(yíng)養(yǎng)狀況[10-11, 15-16]、調(diào)節(jié)寄主次生代謝抗菌物質(zhì)的合成[17- 19]、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)[20- 22]等。但目前對(duì)調(diào)控菌根誘導(dǎo)寄主抗病的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究比較少。

茉莉酸(Jasmonic acid, JA)及其衍生物是一類重要的植物激素,廣泛參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御逆境脅迫的系統(tǒng)響應(yīng)過(guò)程[23]。許多研究表明,JA參與植物對(duì)一些病原菌的抗性反應(yīng)[24-25]。Vijayan等[26]通過(guò)對(duì)擬南芥JA合成缺失三突變體fad3fad7fad8的研究發(fā)現(xiàn),JA是植物抵抗根腐生病菌(Pythiummastophorum. Drechs)所必須的,而外源施加MeJA可以恢復(fù)三突擬南芥fad3fad7fad8對(duì)P.mastophorum的抗性；Koo等[27]和Browse等[28]報(bào)道了JA缺失突變體和JA受體突變體對(duì)腐生型病原菌如畸雌腐霉菌(Pythiumirregulare)、鏈格孢菌輪斑病菌(Alternariabrassicisola)、灰霉菌(Botrytiscinerea)等侵染失去抗性。為了應(yīng)對(duì)和適應(yīng)各種逆境脅迫,植物通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑精細(xì)協(xié)調(diào)生長(zhǎng)和防御之間的平衡,而且這種調(diào)節(jié)也存在于菌根共生過(guò)程中[22]。越來(lái)越多的研究證明JA信號(hào)在菌根形成和菌根誘導(dǎo)的植物抗病性中起到積極的作用[29-30]。Cervantes-Gámez等[16]通過(guò)全基因組分析檢測(cè)菌根番茄植物葉片中基因表達(dá)的變化,并在菌根植株葉片中鑒定到742個(gè)系統(tǒng)防御誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào),隨后對(duì)其中激素相關(guān)基因的分析發(fā)現(xiàn),AMF的定殖可能誘導(dǎo)植物JA的積累；Li等[15]研究也證明菌根真菌侵染后的大豆植株JA含量更高；Pozo等[22]發(fā)現(xiàn)菌根真菌侵染后番茄葉片對(duì)灰霉菌(Botrytiscinerea)感染率顯著低于對(duì)照植株,熒光定量PCR結(jié)果顯示,菌根番茄葉片受JA調(diào)節(jié)的防御基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照?？梢?jiàn),菌根共生能夠誘導(dǎo)植物內(nèi)源激素穩(wěn)態(tài)的變化,進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)逆境脅迫的耐受能力[31-32]。以往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)JA信號(hào)可能參與菌根真菌對(duì)寄主植物抗病性的誘導(dǎo),本研究利用番茄JA信號(hào)途徑過(guò)表達(dá)及突變體材料來(lái)進(jìn)一步證明JA信號(hào)在菌根真菌誘導(dǎo)植物的抗病性中的重要作用,是對(duì)前人研究的補(bǔ)充。

番茄早疫病(tomato early blight)又稱為“輪紋病”,是由半知菌亞門(mén)鏈格孢屬茄鏈格孢菌[Alternariasolani(Ellis et G. Martin) Sorauer] 引起的一種死體營(yíng)養(yǎng)型真菌病害,在我國(guó)是危害番茄的主要病害之一。主要在番茄葉、莖和果實(shí)上發(fā)病。葉片受茄鏈格孢菌侵染后,開(kāi)始時(shí)出現(xiàn)暗褐色小斑點(diǎn),漸漸擴(kuò)大成圓形至橢圓形病斑,并有明顯的同心輪紋,邊緣具黃色或黃綠色暈圈,潮濕時(shí)產(chǎn)生黑色霉層狀態(tài)的病斑。番茄早疫病病原菌危害范圍廣泛,主要危害番茄,還會(huì)危害茄子、辣椒和馬鈴薯等多種茄科蔬菜作物。過(guò)去研究表明,植物對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型真菌病害的抗性與JA信號(hào)途徑有關(guān)。本論文用摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)接種番茄茉莉酸信號(hào)途徑四個(gè)不同基因型材料,待菌根真菌在根系定殖后,進(jìn)行早疫病菌接種和茉莉酸甲酯處理,研究JA在菌根真菌誘導(dǎo)的植物抗病中的作用,揭示菌根影響植物抗病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

番茄茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑前系統(tǒng)素過(guò)表達(dá)材料35S::PS(35S::prosystemin)、茉莉酸合成突變體spr2、茉莉酸信號(hào)識(shí)別突變體jai1及其對(duì)應(yīng)的野生型番茄CM(SolanumlycopersicumMill.cv Castlemart)由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李傳友研究員提供。摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae, Fm)由山東省青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根生物技術(shù)研究所提供,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室用廣東省農(nóng)科院提供的丹652玉米擴(kuò)繁后,以含土壤、孢子、菌絲和根段的混合物作為接種物。病原菌茄鏈格孢菌[Alternariasolani(Ellis et G. Martin) Sorauer, As]由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌研究室周而勛教授提供。培養(yǎng)基質(zhì)土壤取自校內(nèi)農(nóng)場(chǎng), 過(guò)10 mm篩,高壓蒸汽濕熱滅菌2次(30 min/次,103 kPa,121℃),以消除土壤中真菌孢子等其他類群微生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽實(shí)驗(yàn)在玻璃溫室中進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理。對(duì)照組CK：正常健康生長(zhǎng)的番茄植株,不進(jìn)行任何處理；Fm處理：番茄幼苗根系只接種Fm 100 g (約350個(gè)孢子/100 g),番茄葉片未接種As也未噴施MeJA處理的健康番茄植株；As處理：番茄幼苗根系未接種Fm,番茄葉片未噴施MeJA處理,僅在第45天時(shí)接種As的番茄植株；Fm+As 處理：番茄幼苗根系預(yù)先接種Fm 100 g,第45天時(shí)對(duì)番茄葉片進(jìn)行As接種處理,但未噴施MeJA處理的番茄植株；Fm+MeJA+As處理：番茄幼苗根系預(yù)先接種Fm 100 g,在第30天時(shí)對(duì)番茄葉片噴施MeJA,第45天時(shí)接種As。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 Fig.1 Sketch of experiment setup番茄幼苗移栽時(shí)接種叢枝菌根真菌摩西斗管囊霉(Fm),30 d時(shí)對(duì)葉片噴施茉莉酸甲酯(MeJA)處理,45 d時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行茄鏈格孢菌(As)處理

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

番茄種子用8% H2O2消毒10 min,滅菌水沖洗5次后催芽生長(zhǎng)至兩葉期,隨后挑選生長(zhǎng)一致的幼苗移栽到經(jīng)0.1% KMnO4溶液消毒的直徑為16 cm塑料花盆中。塑料盆內(nèi)裝有滅菌的砂壤土2.5 kg,Fm菌劑100 g(對(duì)照未接種Fm菌劑),最后覆蓋0.5 kg滅菌的土壤。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),隨機(jī)擺放在玻璃溫室中,光周期14 h/10 h (L/D),維持相對(duì)濕度在75%,溫度22—25℃,每7 d澆一次Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液。番茄幼苗剛移栽時(shí)接種Fm,在番茄生長(zhǎng)30 d時(shí)每株番茄噴施10 mL MeJA (0.5 μmol/L),以等量加入Triton-X- 100的蒸餾水作為對(duì)照(圖1), 在番茄生長(zhǎng)45 d時(shí)用噴霧法接種As分生孢子懸浮液20 mL(4×107cfu/mL),對(duì)照以等量的無(wú)菌水代替孢子懸浮液(圖1)。番茄植株生長(zhǎng)45 d后經(jīng)乳酸酚臺(tái)盼藍(lán)染色液染色檢測(cè)根系菌根真菌侵染率。其中,MeJA配制方法：MeJA溶于等量Triton-X- 100溶液中后用蒸餾水配置成0.5 μmol/L MeJA溶液,對(duì)照則直接用等量Triton-X- 100加入等量蒸餾水。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1菌根侵染率的測(cè)定

番茄苗生長(zhǎng)30 d和45 d 后分別用打孔器(直徑1 cm)取5個(gè)處理番茄根系各100段,放于盛有存貯液(按體積比配置是99%乙醇：60%乙酸：ddH2O=600∶120∶80)的2.5 mL塑料EP管內(nèi),于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＞秩韭实臏y(cè)定參考Koske等[33]的方法稍加修改：待測(cè)根系首先用ddH2O清洗3次,去除殘留存貯液,隨后加2 mL 2% KOH,并于96℃加熱5 min；其次,用ddH2O清洗3次,去除殘留的KOH,再加2 mL 2% HCl,并于96℃加熱5 min；最后去除殘留的HCl,加入2 mL 0.05% 乳酸酚臺(tái)盼藍(lán)染色液,96℃加熱20 min染色,隨后倒掉染色液,加2 mL脫色液,脫色24 h后于Olympus BX51顯微鏡下觀察Fm侵染情況。菌根侵染率的測(cè)定采用根段侵染率加權(quán)法進(jìn)行計(jì)算[34]。另采用WGA- 488(攜帶Alexa 488熒光標(biāo)記的麥胚凝集素)染色液對(duì)根系進(jìn)行染色,具體方法和步驟參照J(rèn)iang等[35]的方法,隨后用激光共聚焦顯微鏡LSM 510(ZEISS)觀察Fm侵染情況。

1.4.2發(fā)病率和病情指數(shù)的測(cè)定

在確定叢枝菌根真菌Fm侵染番茄植株根系后,在番茄移栽45 d時(shí),對(duì)As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理的番茄葉片接種茄鏈格孢菌。接種病原菌10 d后記錄發(fā)病率和發(fā)病程度。根據(jù)植株發(fā)病的程度計(jì)算病情指數(shù)[36]。發(fā)病程度分為5級(jí),0級(jí)：葉片上無(wú)病斑；1級(jí)：病斑面積占羽狀葉的1/4以下；2級(jí)：病斑面積占羽狀葉的1/4 — 1/2；3級(jí)：病斑面積占羽狀葉的1/2 — 3/4,近一半小葉枯死；4級(jí)：病斑面積占羽狀葉的3/4以上,一半以上或全部小葉枯死。

發(fā)病率(DP)和病情指數(shù)(DI)計(jì)算公式為：

DP =(發(fā)病葉數(shù)/葉片總數(shù))×100%

DI =∑(病級(jí)葉數(shù)×發(fā)病等級(jí))/(發(fā)病最重級(jí)數(shù)×葉片總數(shù))×100%

1.4.3抗氧化物酶活性測(cè)定

稱取1.2處理的番茄葉片0.2 g,加入2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8,內(nèi)含5%聚乙烯吡咯烷酮PVPP),置冰浴上研磨勻漿,隨后轉(zhuǎn)入離心管,4℃ 12000×g離心15 min,取上清液,放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定參照袁慶華等[37]的方法；多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定參照朱廣廉和 鐘海文[38]的方法；脂氧合酶(LOX)活性測(cè)定參照姚鋒先等[39]的方法。

1.4.4總RNA提取和cDNA合成

對(duì)以上5種處理的番茄植株分別在接種病原菌0、5、10 d后進(jìn)行葉片取樣,液氮研磨,用TrizolTMReagent試劑盒(Invitrogen,USA)提供的方法提取番茄葉片總RNA,經(jīng)DNaseI處理后,吸取2g RNA用于cDNA合成。cDNA合成體系為20L,所用試劑盒為Goscript系列Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA放于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5熒光定量PCR分析

依據(jù)已報(bào)道參與抗蟲(chóng)的相關(guān)防御基因：AOC(丙二烯氧化物環(huán)化酶基因)、COI1(茉莉酸信號(hào)受體基因)；Ubi3(番茄組成型表達(dá)基因,內(nèi)參基因)的序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行熒光定量PCR,擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。按照康為世紀(jì)的Ultra SYBR熒光定量PCR試劑盒的程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min,40個(gè)循環(huán)包括95℃變性15 s,退火溫度(AOC：56.5℃；COI1：51.5℃；UBI3：51.5℃)30 s,72℃延伸15 s。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 熒光定量PCR所用的特異性引物

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013軟件錄入數(shù)據(jù)和SPSS 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Origin 2018軟件錄入數(shù)據(jù)和作圖,同一時(shí)間點(diǎn)不同處理之間的差異顯著性用Tukey′s多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 摩西斗管囊霉侵染番茄根系情況

乳酸酚臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果表明,接種Fm的番茄根系(CM、35S::PS、spr2和jai1)在第30天和45天時(shí)均被侵染,且CM、35S::PS和jai1的菌根侵染率較高,而spr2的菌根侵染率最低(表2)。其中第45天時(shí),外源施加MeJA處理的CM植株比正常生長(zhǎng)的CM植株的菌根侵染率高出36%；外源施加MeJA處理的spr2植株比正常生長(zhǎng)的spr2植株的菌根侵染率高出146%；而外源施加MeJA與否對(duì)35S::PS和jai1的菌根侵染率無(wú)顯著影響(表2)。從圖2可以看出,乳酸酚臺(tái)盼藍(lán)染色和WGA- 488熒光染色Fm侵染的番茄根系后,顯微鏡下能看到明顯的叢枝結(jié)構(gòu),說(shuō)明Fm和寄主番茄植株形成了良好的共生關(guān)系。

表2 接種摩西斗管囊霉(Fm)30 d和45 d后番茄根系菌根侵染情況

不同小寫(xiě)字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

圖2 臺(tái)盼藍(lán)和WGA染色下的叢枝結(jié)構(gòu) Fig.2 Arbuscular structure under trypan blue and WGA staining

2.2 不同處理對(duì)葉片防御酶活性的影響

由圖3可知,未接種As時(shí)(0 d),POD、PPO和LOX活性在不同基因型番茄植株的5個(gè)處理中均無(wú)顯著差異。其中,接種As 5 d和10 d后,同CK相比,Fm+As和Fm+MeJA+As處理的CM及35S::PS葉片中的POD酶活性被誘導(dǎo)升高。其中接種As 5 d后,spr2和jai1材料在各處理間的POD酶活性均無(wú)顯著差異；接種As 10 d 后,35S::PS番茄材料中POD酶活性被誘導(dǎo)升高(圖3)。同理,在第10天時(shí),spr2植株的Fm+MeJA+As處理的POD酶活性高于其他4個(gè)處理,說(shuō)明外源施加MeJA可增強(qiáng)spr2材料的抗病性,但其酶活性低于CM和35S::PS材料中相對(duì)應(yīng)的處理(圖3)。而jai1材料的5個(gè)處理間的POD酶活性并無(wú)顯著差異(圖3)。在接種As 5 d、10 d后Fm+As和Fm+MeJA+As處理的CM及35S::PS葉片中的PPO酶活性被誘導(dǎo)升高,分別比CK高出68%,75%和67%,75%,比Fm處理高出55%,61%和55%,62%,比As處理高出52%,59%和52%,59%,而spr2和jai1材料的不同處理間PPO酶活性在接種As 5 d后無(wú)顯著差異,接種As 10 d后僅spr2植株的Fm+MeJA+As處理下PPO酶活性高于其他4個(gè)處理(圖3)。接種As 5 d后,Fm+MeJA+As處理的35S::PS番茄葉片中LOX活性明顯高于其他處理,而CM、spr2和jai1材料的不同處理間LOX酶活性無(wú)顯著差異；接種As 10 d后,CM和35S::PS番茄植株的As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理的LOX酶活性都開(kāi)始顯著上升,分別比CK高出105%,303%,335%和103%,240%,266%；且35S::PS番茄植株的Fm+As和Fm+MeJA+As處理的LOX酶活性分別比AS處理高66%和79%,差異顯著(圖3)。spr2植株的Fm+MeJA+As處理中的LOX酶活性高于其他4個(gè)處理,而jai1材料無(wú)論是否預(yù)先接種Fm、施加MeJA以及接種As,其LOX酶活性在5個(gè)處理間并無(wú)顯著差異(圖3)。可見(jiàn),CM和35S::PS植株的As、Fm+As和Fm+MeJA+As處理都可誘導(dǎo)POD和LOX酶活性升高；而PPO酶活性僅在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下有所升高(圖3)。spr2植株僅在Fm+MeJA+As處理的第10 d有所升高,但其酶活性低于CM和35S::PS材料中相對(duì)應(yīng)的處理(圖3),說(shuō)明Fm誘導(dǎo)番茄提高抗病性與JA是密切相關(guān)的。

圖3 接種摩西斗管囊霉和茄鏈格孢菌及茉莉酸甲酯處理對(duì)不同基因型番茄葉片過(guò)氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和脂氧合酶(LOX)活性影響Fig.3 Effects of inoculation of Funneliformis mosseae and Alternaria solani, and treatment with methyl jasmonate (MeJA) on enzymes activities of peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), and lipoxygenase (LOX) in the leaves of four tomato genotypesCK：對(duì)照；Fm：番茄幼苗根系僅接種摩西斗管囊霉；As：番茄葉片僅接種茄鏈格孢菌；Fm+As：番茄幼苗根系預(yù)先接種摩西斗管囊霉后在對(duì)葉片接種茄鏈格孢菌；Fm+MeJA+As：番茄幼苗根系預(yù)先接種摩西斗管囊霉后,對(duì)葉片外源噴施茉莉酸甲酯,最后接種茄鏈格孢菌;不同小寫(xiě)字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

2.3 不同處理對(duì)番茄茉莉酸合成途徑基因及茉莉酸受體防御啟動(dòng)基因表達(dá)的影響

由圖4可以看出,第0天時(shí),CM、35S::PS、spr2和jai1材料的不同處理的番茄葉片中AOC 和COI1基因表達(dá)量無(wú)顯著差異；第5天時(shí),預(yù)先接種Fm并且施加MeJA處理的CM、35S::PS及spr2番茄植株在受到As侵染時(shí),AOC基因表達(dá)量迅速升高,分別比CK高出12.2、13.1、7.4倍,比Fm處理高出11.1、12.3、7倍,比As處理高出5.7、5.1、6.2倍；接種As 10 d后,CM及35S::PS番茄植株在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下,其AOC基因被誘導(dǎo)表達(dá),說(shuō)明預(yù)先接種Fm番茄的AOC基因?qū)τ贏s侵染有更強(qiáng)的響應(yīng),且外源噴施MeJA會(huì)使這種響應(yīng)更為迅速。隨著As侵染時(shí)間的延長(zhǎng),CM及35S::PS番茄葉片中AOC基因也被誘導(dǎo)表達(dá)。同理,接種As 5 d后,35S::PS葉片中Fm+As和Fm+MeJA+As處理下COI1基因被誘導(dǎo)表達(dá),分別比CK高出2.6倍和6.1倍,CM和spr2葉片中的Fm+MeJA+As處理下COI1基因表達(dá)量分別比CK高出3.1倍和1.9倍(圖4)。接種As 10 d后,CM及35S::PS番茄葉片在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下,其COI1基因的誘導(dǎo)表達(dá)量分別比CK高9.5、10.3倍和9.9、6.7倍。外源噴施MeJA處理的spr2葉片中AOC和 COI1基因可被誘導(dǎo)表達(dá),而jai1材料5個(gè)處理中的AOC和 COI1基因均無(wú)顯著變化(圖4)。

圖4 接種摩西斗管囊霉和茄鏈格孢菌及茉莉酸甲酯處理對(duì)不同基因型番茄葉片丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(AOC)和茉莉酸信號(hào)受體基因(COI1)的影響Fig.4 Effects of inoculation of Funneliformis mosseae and Alternaria solani, and treatment with methyl jasmonate (MeJA) on transcript levels of genes encoding allene oxide cyclase (AOC) and CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1) in the leaves of four tomato genotypesCK：對(duì)照；Fm：番茄幼苗根系僅接種摩西斗管囊霉；As：番茄葉片僅接種茄鏈格孢菌；Fm+As：番茄幼苗根系預(yù)先接種摩西斗管囊霉后在對(duì)葉片接種茄鏈格孢菌；Fm+MeJA+As：番茄幼苗根系預(yù)先接種摩西斗管囊霉后,對(duì)葉片外源噴施茉莉酸甲酯,最后接種茄鏈格孢菌。不同小寫(xiě)字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著性 (P<0.05)

2.4 不同處理的番茄植株在接種早疫病菌10 d后的發(fā)病率和病情指數(shù)

由表3數(shù)據(jù)得出,由于CK及Fm處理的各基因型番茄并未接種早疫病病原菌茄鏈格孢菌(As),故發(fā)病率和病情指數(shù)均為0。而As、Fm+As以及Fm+MeJA+As處理下的4個(gè)基因型番茄均有發(fā)病,其中與單獨(dú)接種As相比,預(yù)先接種Fm可減緩CM和35S::PS番茄植株的發(fā)病率和病情指數(shù),且繼續(xù)在外源噴施MeJA后,發(fā)現(xiàn)可顯著降低番茄的發(fā)病情況(表3)。此外,35S::PS的抗病能力最強(qiáng),在Fm+As和Fm+MeJA+As處理下其發(fā)病率最低。預(yù)先接種Fm的spr2植株中,雖然發(fā)病趨勢(shì)有所減緩,但與僅被As侵染的spr2相比,發(fā)病率差異不顯著；而預(yù)先接種Fm在進(jìn)行回補(bǔ)MeJA的spr2植株中,發(fā)病率和病情指數(shù)均有顯著下降(表3)。而在jai1植株中,是否預(yù)先接種Fm,以及是否進(jìn)行MeJA回補(bǔ),對(duì)其發(fā)病率和病情指數(shù)均無(wú)影響,早疫病發(fā)病率均達(dá)到50%以上。同理,在接種As 10 d后,CM和35S::PS植株中As、Fm+As以及Fm+MeJA+As處理間的發(fā)病率和病情指數(shù)依次降低且處理間差異均顯著(表3)。

表3 接種摩西斗管囊霉和外源添加茉莉酸甲酯對(duì)4種基因型番茄早疫病發(fā)病的影響

Table 3 Effect of mycorrhizal inoculation byFunneliformismosseaeand exogenous application of methyl jasmonate (MeJA) on early blight disease infected byAlternariasolaniain four tomato genotypes

處理Treatment病情指數(shù) Disease index發(fā)病率 Disease incidence/%CM35S::PSspr2jai1CM35S::PSspr2jai1CK0d0d0c0b0c0d0c0bFm0d0d0c0b0c0d0c0bAs34.6±3.7a28.3±2.5a48.0±3.1a56.0±9.4a42.3±3.4a31.4±2.5a52.0±3.1a54.0±9.4aFm+As22.0±5.4b17.0±5.5b43.3±3.8a58.3±4.2a33.3±5.4b14.5±5.5b48.1±3.8ab53.2±4.2aFm+MeJA+As12.3±3.8c11.3±4.3c31.6±2.7b49.6±10.9a31.0±3.8b15.8±4.3c35.6±2.7b50.1±10.9a

同列不同小寫(xiě)字母表示同一基因型番茄不同處理間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論和討論

叢枝菌根真菌侵染寄主植物后會(huì)促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)、引起植物分子和生化反應(yīng)[40-42]。AMF侵染植物根系形成菌根過(guò)程中,可通過(guò)水楊酸(salicylate acid, SA)與茉莉酸信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)植物防御系統(tǒng),進(jìn)而提高植物應(yīng)對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的能力[20, 31]。尤其茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在叢枝菌根真菌侵染寄主、形成菌根過(guò)程中起到非常重要的作用。Hause等[29]和Miriam等[43]的研究表明,茉莉酸一系列前體合成基因的表達(dá),特別是AOC及Fad2在菌根結(jié)構(gòu)的形成中必不可少。此外,茉莉酸在真菌性病原菌、蟲(chóng)害誘導(dǎo)以及機(jī)械損傷的直接和間接防御反應(yīng)中也起重要作用[44-45]?；诖?本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用過(guò)表達(dá)前系統(tǒng)素轉(zhuǎn)基因番茄(35S::Prosystemin)、JA合成突變體番茄(spr2)、茉莉酸識(shí)別突變體(jai1)及其對(duì)應(yīng)的野生型番茄(CM)研究了茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在菌根誘導(dǎo)番茄的抗病過(guò)程中的作用機(jī)制。

眾所周知,不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由不同類型的病原菌誘發(fā),即不同的病原體侵染植物,植物啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑就可能不同,活體營(yíng)養(yǎng)型的病原微生物誘發(fā)SA依賴的信號(hào)途徑,壞死營(yíng)養(yǎng)型的病原微生物或機(jī)械傷害卻觸發(fā)JA-ET(ethylene, ET)依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在菌根誘導(dǎo)的番茄抗病防御反應(yīng)中,來(lái)源于類十八烷的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,即茉莉酸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,被認(rèn)為在植物的防御機(jī)制中起核心作用[46-47]。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是亞麻酸通過(guò)脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)、丙二烯氧化物合酶(allele oxide sysnthase, AOS)等一系列酶促反應(yīng),最終生成植物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)茉莉酸及其衍生物MeJA的生物合成途徑。同樣,與植物代謝有密切關(guān)系的LOX、防御酶PPO以及作為植物體內(nèi)主要抗氧化酶和活性氧清除劑的POD也參與植物的防御反應(yīng),酶活性的提高是誘導(dǎo)防御物質(zhì)產(chǎn)生和增加防御能力的前提[48-49]。

本研究中,不同基因型番茄所表現(xiàn)出的抗病性差異,更加清晰的證明AMF與JA信號(hào)途徑之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明,預(yù)先接種Fm的CM和35S::PS番茄,在葉片接種As(處理Fm+As)的5和10 d后,其葉片中POD、PPO和LOX活性以及AOC和COI1的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于As、Fm和CK處理組,且發(fā)病率和病情指數(shù)也顯著降低。同時(shí),外源噴施MeJA可增強(qiáng)預(yù)先接種Fm的CM和35S::PS番茄植抵抗早疫病的能力。而jai1番茄對(duì)As和MeJA處理并無(wú)防御響應(yīng),可見(jiàn)Fm侵染誘導(dǎo)提高番茄抗早疫病是與JA途徑密切相關(guān)的。此外,spr2突變體番茄植株中的Fm侵染率、酶活性和基因表達(dá)降低,可能的原因是AM孢子在侵染的過(guò)程中依賴于茉莉酸途徑來(lái)促進(jìn)地上部代謝物偏向地下部運(yùn)轉(zhuǎn),菌根從中吸取營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)代謝；也可能由于茉莉酸合成途徑的一些中間產(chǎn)物,如亞麻酸,為菌根結(jié)構(gòu)建立重要的碳源,缺乏時(shí)則會(huì)造成AMF在寄主根內(nèi)發(fā)育不良。在jai1突變體中,植株失去了調(diào)節(jié)外源真菌侵染的能力,使得AMF的侵染率及早疫病菌的侵染上升。對(duì)于以JA作為內(nèi)源激素進(jìn)行生理及抗性調(diào)節(jié)的植株來(lái)說(shuō),JA途徑的激活調(diào)節(jié)了其與周邊環(huán)境中微生物之間的關(guān)系?？梢?jiàn),JA途徑的激活是AMF與番茄植株建立共生關(guān)系的必要過(guò)程,但是JA途徑主要調(diào)控的是寄主植物與AMF的共生關(guān)系,還是作為長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)男盘?hào)分子在寄主植物受到病害時(shí)快速誘導(dǎo)系統(tǒng)防御的增強(qiáng),抑或兼而有之,需要進(jìn)一步研究?？傊?良好共生關(guān)系的構(gòu)建是AMF誘導(dǎo)植物提高抗病性的基礎(chǔ)和前提。